劉修權,曲偉杰,高 健,王 志,Rashad Abdulkarim Alkasir,蘇敬良,韓 博
(1.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 海淀100193;2.云南農業(yè)大學動物科學技術學院,云南 昆明650201)
Jacobsen(1910)分離到一種異常的傷寒埃伯澤氏菌株,并依其特殊的表型特征命名為小菌落突變株(small colony variants,SCVs)[1]。自此,人們開始了對SCVs的研究。深入研究發(fā)現,許多細菌(如表皮葡萄球菌、頭葡萄球菌、綠膿桿菌、洋蔥伯克氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌、羊布魯桿菌、大腸埃希氏桿菌、乳酸桿菌、粘質沙雷菌及淋病奈瑟氏菌等)都具有形成這種小菌落突變株的能力,并先后從膿腫、血液、骨骼、關節(jié)、呼吸道和軟組織中分離到 SCVs。Jensen(1957)首次報道了金黃色葡萄球菌小菌落突變株(SASCVs)[2]。目前,SASCVs的研究最為廣泛深入,現已將其作為研究SCVs的模式微生物。
SASCVs最為典型的特征是菌落細小,僅有其野生株菌落大小的1/10左右。此外,與典型的金黃色葡萄球菌相比,它們還具有色素生成和溶血能力降低、凝固酶形成遲緩等異常的生理生化特性。所有這些表型的出現,可歸因于SASCVs緩慢的生長速度?;诖?早期人們對SCVs的研究主要集中于探索其營養(yǎng)缺陷型,試圖闡明SCVs生長緩慢的機制。其中經典的方法就是“化學限定培養(yǎng)基補償試驗”,以SASCVs的回復性來判斷其具體營養(yǎng)缺陷類型。后來,人們陸續(xù)發(fā)現了一些化合物能促使SASCVs恢復到正常的表型[3],而這些化合物多為野生株的次級代謝產物,包括不飽和脂肪酸、CO2、甲萘醌、血紅素和硫胺素。其中,甲萘醌、血紅素和硫胺素的作用最大,絕大多數SASCVs都是此3種物質的特異營養(yǎng)突變株。
SASCVs與其親本株相比,其氧化磷酸化的能力明顯降低。由此,人們從生物能角度出發(fā),為SASCVs的研究掀開了嶄新的一頁。近年來,人們對細菌新陳代謝及生物能的理解日益加深,最近研究表明,SASCVs實質上是一種電子傳遞鏈缺陷型突變株。
S.aureus主要的產能方式是需氧呼吸。它通過多重酶促反應利用內、外源營養(yǎng)物質而生成NADH、FADH2等還原性物質,并將攜帶的氫原子以質子和電子的形式在呼吸鏈上傳遞,同時也會逐步釋放能量以偶聯的方式生成ATP。呼吸鏈是由NADH脫氫酶、黃素蛋白、鐵硫蛋白、細胞色素、醌及其衍生物組成并按氧化-還原電位由高到低的次序不對稱排列的多酶氧化-還原體系。呼吸鏈的完整性是其發(fā)揮正常功能的基本前提。一旦某一組分功能喪失或降低,勢必造成連鎖效應使下游酶促反應中止,致使整個呼吸鏈處于癱瘓狀態(tài)。這樣,細菌ATP合成受阻,菌體可利用的能量不足,生長速度減慢,進而形成SCVs表型。
盡管細菌多種新陳代謝的改變都能引起生長速度緩慢,但到目前為止,SASCVs臨床分離株多數是由于呼吸作用時合成能量不足所致,主要表現為與呼吸鏈相關的特異營養(yǎng)缺陷類型。依呼吸作用時ATP的生成過程不同,可將SCVs分為兩種營養(yǎng)缺陷類型,即電子傳遞鏈缺陷型和胸腺嘧啶脫氧核苷合成缺陷型。
電子傳遞鏈缺陷型是最典型的SASCVs營養(yǎng)缺陷類型,具有菌落細小、色素生成能力降低和不發(fā)酵甘露醇等特征。大量報道指出,在化學限定培養(yǎng)基中加入甲萘醌或血紅素時,此類SASCVs可以恢復至野生株表型,表明此類SASCVs是由于甲萘醌或血紅素合成障礙所致。甲萘醌和血紅素合成受阻導致SASCVs表型的機制如下:首先,甲基萘醌是細菌合成輔酶Q(CoQ)的前體物質,而CoQ則能從NAD+脫氫酶系、FAD等接受電子,并將獲得的電子傳遞給呼吸鏈的另一重要電子載體(QH2-細胞色素c還原酶復合體);其次,血紅素種類頗多,它們是多種呼吸酶的功能單位??梢?如果甲基萘醌或/和血紅素的合成受阻,將會中止呼吸鏈,造成ATP合成不足使細菌呈現SCVs表型。鑒于此,可以將此類電子傳遞鏈缺陷型SASCVs進一步分為甲萘醌營養(yǎng)缺陷型和血紅素營養(yǎng)缺陷型。此外,硫胺素生物合成受阻也會導致SASCVs表型,稱之為硫胺素缺陷型SASCVs。不過,因為細菌在合成甲萘醌時,嚴格需要硫胺素的參與,故普遍認為該型SASCVs是甲萘醌缺陷型SASCVs的一個亞型。
胸腺嘧啶脫氧核苷合成缺陷型SASCVs的表型與電子傳遞鏈缺陷型基本相同,但這種SASCVs的形成機制至今尚未明確。正常的金黃色葡萄球菌能夠分泌大量的DNase,可分解膿汁中的DNA釋放胸腺嘧啶脫氧核苷供其利用來維持野生表型,但仍能從其中分離到這種SASCVs。鑒于此現象,有人提出“雙重突變子假說”來闡釋胸腺嘧啶脫氧核苷合成缺陷型SASCVs的形成機制。該假說認為:此類SASCVs對外源胸腺嘧啶脫氧核苷吸收受阻,可能是由于其膜上的胸腺嘧啶脫氧核苷載體蛋白突變所致。Saxild等和Smith等研究指出,金黃色葡萄球菌胸腺嘧啶脫氧核苷的攝入依賴于一種電化學梯度依賴性的跨膜蛋白-NupC,且這種蛋白在金黃色葡萄球菌僅有一種,而電化學梯度的維持需要ATP水解釋放能量來完成[4-5]。這樣,金黃色葡萄球菌SCVs由于能量不足使DNase合成量下降,同時NupC蛋白功能也受到限制,進而外源胸腺嘧啶脫氧核苷利用受阻而使ATP合成量降低。反之,ATP合成受限亦會加劇DNase合成量的下降并影響NupC蛋白作用,使菌體能量更為不足,最終形成SCVs。
事實上,多種物質的合成受阻都可能引起金黃色葡萄球菌形成SASCVs。除了上述兩類SASCVs外,人們相繼報道了一些其他類型的SCVs營養(yǎng)缺陷型(如CO2營養(yǎng)缺陷型[6-7]),還有一些營養(yǎng)缺陷不明的SASCVs分離株。鑒于此,Proctor等人推測,F0F1-ATPase及細胞色素等物質合成缺陷,雖不會導致細菌甲萘醌和血紅素合成受阻,但卻同樣可使呼吸鏈癱瘓而形成SASCVs表型[8]。
SACVs與其親本株可同時出現在同一病料中,而SASCVs可以快速回復成野生株表型,且這種轉化在體內外均可進行。鑒于此,Proctor等提出SCVs的形成是在菌體內基因調控系統(tǒng)的作用下實現的[8]。不過,采用脈沖場凝膠電泳技術對SCVs及其親本株分型表明,二者的電泳圖譜卻不盡相同[9]。因而,隨機突變、類似于大腸桿菌一型菌毛的“相變異”等基因改變可能是SASCVs形成的主要原因所在[10]。
雖然臨床上有許多SASCVs分離的報道,但想要確切定位SASCVs臨床分離株基因突變位點絕非易事。許多研究已經證明,SASCVs的出現與呼吸鏈受損有關。故而,可以通過化學限定培養(yǎng)基補償試驗確定其屬于何種物質的營養(yǎng)缺陷型,然后結合分子生物學原理和技術對基因突變進行檢測。例如,為甲萘醌缺陷型SASCVs補充氧琥珀酰苯酸鹽能使其恢復至野生表型,而補充異分支酸鹽則不然,由此可知甲萘醌生物合成途徑受阻部位在這兩種物質之間。目前,已經報道多種基因(ctaA、menB、menD 、hemA 、hemB 、hem H 、mutS 、f usA 、thyA)的突變均能導致S.aureus出現SASCVs表型。
SASCVs臨床分離株有時可表現為多種營養(yǎng)缺陷共存,且表型多不穩(wěn)定。為了研究的需要,近年來研究者們建立了幾種表型穩(wěn)定的S.aureus基因缺失株,如hemB缺失株、menD缺失株和thyA缺失株,它們都具有SASCVs臨床分離株的典型特征。在此基礎上,人們對SASCVs進行了更為深入廣泛的研究。Sifri等(2006)用hemB和menD缺失株建立了秀麗線蟲感染模型并對SASCVs的毒力進行了研究[11]。Kohler等(2003)應用二維電泳和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術,從蛋白組學水平對hemB突變株代謝途徑進行了研究[12]。Atalla等(2009)以牛源 SASCVs分離株(Heba 3231)和牛源S.aureus Nowbould株及其hemB缺失株誘導試驗性奶牛乳房炎,并對其體細胞數和臨床癥狀進行了研究[13]。von Eiff等(2006)對hemB、menD基因缺失株及其親本株的表型矩陣進行了比較研究,其結果表明,兩者均對多種碳源的利用受阻,其中menD對碳源利用的受阻最為嚴重;在呼吸量癱瘓時,生成ATP的磷酸己糖等糖水化合物能刺激二者的生長;兩者對亞硒酸鹽、亞碲酸鹽及硝酸鹽的敏感性較高[14]。Brouilllette等(2004)對牛源S.aureus Nowbould株及其hemB缺失株誘發(fā)的小鼠乳房炎的抗藥作用進行了研究,結果表明,SASCVs表型可能是金黃色葡萄球菌在抗菌藥作用下體內持續(xù)感染的主要原因之一[15]。
1980年,人們首次證明SASCVs與人類的許多疾病相關[16]。Proctor等(1995)從5名S.aureus慢性或復發(fā)性感染病人分離到5株SASCVs,提出“SASCVs與慢性或復發(fā)性感染有關”的假說[3]。此后,人們才意識到SASCVs對持續(xù)性或復發(fā)性感染的具有重要意義,并展開相關性研究。迄今為止,臨床上報道的與SASCVs有關的疾病多種多樣,其中以纖維囊化癥最為常見。此外,已報道的與SASCVs相關的疾病還包括鎖骨關節(jié)炎、慢性骨髓炎、艾滋病繼發(fā)感染、疝切開術術后創(chuàng)口感染、腦水腫、起搏器植入引起的血源性感染、腦室腹膜分流術繼發(fā)感染、假肢移植感染、慢性軟組織感染、中耳炎、支氣管炎、腹膜炎及敗血癥等。
如上所述,SASCVs在人醫(yī)上報道相對較多,其對慢性感染疾病的重要意義已基本達成共識。然而,SASCVs在動物疾病方面的研究卻相對滯后,與奶牛乳房炎相關SASCVs的報道更為匱乏。Sompolinsky等(1974)在以色列的某牛場中,發(fā)現SASCVs與慢性乳房炎有關[17]。Atalla等(2008)首次報道從11頭慢性乳房炎患牛乳汁中分離一株表型穩(wěn)定的SASCVs,并對其生化特征、內皮細胞內持續(xù)及基因轉錄譜等方面的特性進行了研究,表明SASCVs可能是慢性乳房炎持續(xù)的一個主要原因[18]。此后,又對SASCVs株及人工基因缺失SASCVs進行了其他相關研究。
S.aureus基因具有極大的可塑性,在自然選擇作用下,能自發(fā)形成SASCVs。在此過程中,抗生素的長期使用及宿主的免疫機制起著至關重要的作用。首先,臨床上分離到的SASCVs多是胸腺嘧啶核苷合成缺陷型和電子傳遞缺陷型兩大類。前者主要出現在長期應用復方新諾明等磺胺類藥物的病例,主要是因為復方新諾明能夠阻止四氫葉酸的合成,而四氫葉酸是胸腺嘧啶核苷酸合成酶(催化dUMP轉化為dTMP,而dTMP是合成DNA的原料)的一個輔基。后者卻與氨基糖苷類抗菌藥物的使用密切相關。不論體內外,在氨基糖苷類藥物存在的情況下,S.aureus形成SCVs的概率均顯著提高。Pelletier等也報道,Lg7.0CFU的S.aureus野生株在含有1 μ g/mL的慶大霉素培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h,能形成 SASCVs[19]。此外,Atalla等研究發(fā)現,慶大霉素能誘導牛源性S.aureus野生株轉化為表型不穩(wěn)定的SASCVs[18]。氨基糖苷類對SCVs的篩選作用可能與細菌30 S核糖體亞基校正功能喪失有關:氨基糖苷類藥物與30 S核糖體亞基結合后,改變其校對功能,導致蛋白質的錯誤翻譯而使表型改變。一些特殊蛋白質(如DNA聚合酶Ⅲε亞基)的錯誤翻譯又進一步使DNA聚合酶Ⅲ堿基校對功能降低或喪失而導致增突變基因表型的出現。與此同時,蛋白質的錯誤翻譯還可激活應激性誘變途徑。然而,氨基糖苷類藥物誘導SCVs的確切機制至今仍未闡明,有待進一步研究。
其次,胞內環(huán)境也有利于SASCVs的選擇和存活。體外培養(yǎng)的內皮細胞的胞內環(huán)境能選擇自然形成的SASCVs,而S.aureus野生株侵入原代牛乳腺上皮細胞后,對細胞裂解物的培養(yǎng)可形成親本株與SCVs表型的混合菌群。
再者,Mitchell等最近報道,含有綠膿桿菌4-羥基-2-庚基喹啉氮氧化物(HQNQ)的培養(yǎng)基上清液能誘導S.aureus形成SASCVs,繼而形成生物被膜。進一步研究還發(fā)現,HQNQ存在時,б因子B亦受到激活,同時附加基因調控系統(tǒng)(accessory gene regulator,AGR)則受到抑制;無HQNQ時,則不然。因而,Mitchell等指出綠膿桿菌HQNQ通過激活金黃色葡萄球菌б因子B而使其形成SASCVs和生物被膜[20]。
SASCVs特殊的表型和生理生化特征使其分離、鑒定及藥敏試驗變得尤為困難,給微生物研究及醫(yī)務工作者帶來了嚴重挑戰(zhàn)。SASCVs菌落形態(tài)異常,生化反應喪失或降低,傳統(tǒng)的實驗室技術對SASCVs的分離鑒定效果很不理想。因而,探索SASCVs分離鑒定技術勢在必行。Kipp等(2005)報道,采用哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基和一種新型的顯色培養(yǎng)基(S.aureus ID agar)可大大提高SASCVs的分離培養(yǎng)率[21]。SASCVs的分裂速度比其野生株慢9倍,當野生株與SCVs共存培養(yǎng)時,野生株的過度生長會造成SCVs的丟失而呈現假陽性,而應用PCR技術檢測金黃色葡萄球菌一些種間特異基因(如nuc、coa等)可進一步確實檢測結果。此外,Kipp等報道,應用16S rDNA原位雜交技術檢測一例腦水腫患者病料,檢測出S.aureus后又經延時培養(yǎng),最終分離到1株SASCVs[22]。
目前,抗生素仍是治療細菌性感染的首選藥物。然而,與其親本株相比,臨床上分離的SCVs對抗生素的耐藥性更為嚴重。首先,膜電勢(△Ψ)能夠促進細菌對氨基糖苷類抗生素的攝入。SASCVs由于ATP合成不足,無法維持正常的膜電勢,導致氨基糖苷類抗生素無法進入細菌胞質發(fā)揮其作用,從而造成SASCVs的耐藥性。SASCVs對陽離子多肽的耐藥性機理也與此類似[23]。其次,SASCVs生長緩慢,細胞壁分裂能力降低,因而β-內酰胺類等作用于細胞壁的抗菌作用降低。最后,SASCVs能存活于多種特異及非特異的吞噬細胞,并調停免疫反應,從而達到規(guī)避多種抗生素作用的目的。
另外,由于SASCVs臨床分離株生長緩慢,且多與其野生株共存。因而,在常規(guī)藥敏試驗中,一方面,會因培養(yǎng)時間過短而造成假陰性;另一方面,臨床上它們多與野生株呈異質性,共同培養(yǎng)時易被其野生株的過度生長而掩蔽,導致藥敏試驗呈假陽性。鑒于此,為了彌補常規(guī)藥敏試驗的不足,探索若干有效的耐藥性檢測技術(如PCR檢測耐藥基因等)顯得尤為重要。
由于SASCVs與多種持續(xù)性感染密切相關,要對其徹底治愈,必須研究合適的藥物及給藥方式。然而,目前尚無清除 SASCVs的特效藥的報道。Kipp等(2003)報道,將萬古霉素、利福平及替考拉寧配伍使用而徹底治愈一例由SASCVs感染所致的腦水腫[22]。Baltch等報道,將達托霉素、利福平及慶大霉素合用、達托霉素-利福平及慶大霉素-利福平配伍使用對清除人單核細胞源性巨噬細胞內的SASCVs效果最為明顯,而在液體培養(yǎng)基中,單獨使用達托霉素、達托霉素-慶大霉素配伍、利福平-慶大霉素配伍及三者配伍,它們對SASCVs的清除效果相近[24]。Baltch等(2009)對達托霉素抗SASCVs的療效進行研究指出,達托霉素可用于治療SASCVs所致的慢性或復發(fā)性感染[25]。SASCVs所致的慢性感染治療極為棘手,因而,有必要探索合適的給藥方式,研發(fā)療效更為明顯的抗菌藥物。
由于呼吸鏈癱瘓,S.aureus會形成具有特殊表型的SCVs。這種SASCVs能侵入多種特異或非特異吞噬細胞引起慢性或復發(fā)性感染,其臨床SASCVs分離株多數是甲萘醌、血紅素或硫胺素的營養(yǎng)缺陷體,對多種抗生素產生耐藥性。目前的研究表明,基因突變是造成S.aureus呼吸鏈癱瘓的遺傳學基礎。因而,檢測SASCVs臨床分離株突變基因,可以加深人們對SASCVs新陳代謝及毒力因子表達等方面的機制的了解,對解決金黃色葡萄球菌慢性感染性疾病具有重要的意義。
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