王 吉，衛(wèi) 禮，岳秉飛，賀爭鳴

（中國藥品生物制品檢定所、國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心，北京 100050）

呼腸孤病毒Ⅲ型（Reo3）屬呼腸孤病毒科的正呼腸孤病毒屬。此種病毒可感染所有哺乳動(dòng)物，包括小鼠、地鼠、豚鼠、貓和犬等［1-2］。并且能在人、猴、豚鼠、地鼠、貓、狗、豬和牛的原代腎細(xì)胞以及Hela、KB、FL和L細(xì)胞等傳代細(xì)胞中增殖并引起細(xì)胞病變。Reo3也能感染人，能引起兒童腹瀉、呼吸道感染及腦膜炎等疾?。?-4］。由于上述動(dòng)物和細(xì)胞存在Reo3的自然感染，而用上述動(dòng)物原材料或細(xì)胞而生產(chǎn)的人用生物制品也可能存在Reo3的潛在污染，對(duì)人用動(dòng)物原材料及動(dòng)物源性生物制品的使用安全性造成潛在威脅［5］。

因此建立Reo3免疫熒光（IFA）檢測(cè)方法，開展對(duì)人用動(dòng)物原材料及動(dòng)物源性生物制品外源Reo3的檢測(cè)，保證生物原材料及制品的使用安全性至關(guān)重要。本文旨在建立簡單、快速、特異、敏感的免疫熒光檢測(cè)方法，對(duì)人用動(dòng)物源性生物材料及其制品進(jìn)行Reo3檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

Reo3毒種、BSC-1細(xì)胞、BHK21細(xì)胞：本室凍存；免疫熒光素（山羊抗小鼠IgG-FITC）：KPL公司產(chǎn)品；SPF BALB/c小鼠，中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心生產(chǎn)（許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0017）；小鼠抗Reo3血清及小鼠陰性血清：本室制備；乙型腦炎減毒活疫苗：本所疫苗一室提供。

1.2 主要儀器

熒光顯微鏡：Olympus IX；37℃水浴箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司DK-4500B型；37℃培養(yǎng)箱：WGP-600；多孔熒光片：Thermo公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 敏感細(xì)胞的篩選和病毒感染力滴度（TCID50）測(cè)定：選擇BHK21細(xì)胞和BSC-1細(xì)胞分別接種Reo3毒種，每天觀察細(xì)胞病變（CPE）。待細(xì)胞50％～80％發(fā)生圓縮病變后，收凍。分別將第3代BHK21細(xì)胞毒和BSC-1細(xì)胞毒以10-1～10-11作系列倍比稀釋，依次加入培養(yǎng)有BHK21細(xì)胞和BSC-1細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（costor）（1～11列），每個(gè)稀釋度接種1列（8孔），第12列不加病毒，作為細(xì)胞對(duì)照。置37℃培養(yǎng)觀察10d，記錄結(jié)果［6］。

1.3.2 Reo3陽性血清與陰性血清的制備：

1.3.2.1 免疫抗原的制備與純化：收獲Reo3細(xì)胞毒于4℃，10 000r/min離心1h，取上清液于4℃，40 000r/min離心3h，收集沉淀于適量PBS中。再經(jīng)20％蔗糖離心后，用紫外分光光度法測(cè)定抗原蛋白含量。然后用PBS稀釋至1mg/mL，分裝后凍存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 免疫接種方法及程序：（1）第一次免疫：取0.3mL純化Reo3抗原與0.9mL弗氏完全佐劑混勻，腹腔注射6只SPF KM小鼠，每只注射0.2mL。（2）第二次免疫：在第一次免疫后第14天，取0.3mL純化Reo3抗原與0.9mL弗氏完全佐劑混勻，腹腔注射每只小鼠0.2mL，同時(shí)每只腹腔注射0.5mL液體石蠟。（3）第三次免疫：在第一次免疫后第21天，取0.3mL純化后Reo3抗原，加入0.9mL弗氏完全佐劑中，混勻后腹腔注射每只小鼠0.2mL。

1.3.2.3 抗體的檢測(cè)：第一次免疫后第35天開始收集腹水，每次收集后2 000r/min離心10min，上清液56℃滅活30min，凍存于-70℃?zhèn)溆?，收集的腹水用本室ELISA法測(cè)其效價(jià)，留取A490＞1.0的腹水混合后分裝至1.5mL離心管中凍存于-70℃作為陽性對(duì)照備用。

1.3.2.4 陰性對(duì)照血清制備：分離的SPF小鼠血清，經(jīng)Reo3 ELISA檢測(cè)為陰性的樣品，56℃滅活30min，用本室ELISA法測(cè)其效價(jià)＜0.1，分裝至1.5mL離心管中凍存于-70℃作為陰性對(duì)照備用。

1.3.3 抗原片的滴定：接種Reo3的敏感細(xì)胞，病變達(dá)70％～80％，滴片，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。冷丙酮固定，置-20℃凍存?zhèn)溆茫?］。

1.3.4 操作和判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定：依據(jù)《中華人民共和國藥典》2010版三部和國標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和結(jié)果判定。在陰、陽對(duì)照成立的情況下，待檢血清與正常細(xì)胞反應(yīng)無熒光，與感染細(xì)胞反應(yīng)有熒光判為陽性［7-8］。

1.3.5 免疫熒光素最佳工作濃度的確定：小鼠Reo3陽性血清及陰性血清分別以1：10稀釋［7］，羊抗小鼠IgG-FITC以1：50～1：3200進(jìn)行系列倍比稀釋，滴定熒光抗體最佳工作濃度。以出現(xiàn)“++++”的熒光抗體最大稀釋比例為其最佳工作濃度。

1.3.6 敏感性試驗(yàn)：將小鼠陽性血清從1：10～1：5120進(jìn)行系列倍比稀釋進(jìn)行檢測(cè)，以出現(xiàn)“++”的最大稀釋比例為其檢測(cè)靈敏度；將Reo3細(xì)胞毒以10-1～10-11作系列倍比稀釋，分別接種BSC-1細(xì)胞，48h后分別滴片，與陽性血清進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)，以檢測(cè)到出現(xiàn)“++”的病毒感染滴度來確定檢測(cè)方法的敏感性。

1.3.7 特異性試驗(yàn)：用建立的IFA法分別檢測(cè)小鼠鼠痘（Ect）病毒和小鼠肝炎病毒（MHV）陽性血清，同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽對(duì)照。用小鼠Reo3陽性血清和陰性血清與小鼠鼠痘（Ect）病毒感染BHK21細(xì)胞片進(jìn)行交叉免疫熒光試驗(yàn)；同時(shí)與正常BSC-1細(xì)胞和Reo3感染BSC-1細(xì)胞進(jìn)行玻片免疫熒光試驗(yàn)。

1.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)：將3個(gè)不同批次抗原片同時(shí)對(duì)小鼠陽性血清從1：10～1：5120進(jìn)行檢測(cè)；同1批次抗原片于-20℃保存1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月3個(gè)不同時(shí)間，分別對(duì)小鼠陽性血清從1：10～1：5120進(jìn)行檢測(cè)，觀察其檢測(cè)結(jié)果是否一致。

1.3.9 初步應(yīng)用：

1.3.9.1 動(dòng)物抗體的檢測(cè)：用建立的IFA方法對(duì)2008年～2010年國內(nèi)7個(gè)廠家送檢60份小鼠血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，并記錄結(jié)果。

1.3.9.2 Reo3抗原的檢測(cè)：利用細(xì)胞試驗(yàn)和IFA法對(duì)人用動(dòng)物源性材料及生物制品進(jìn)行檢測(cè)。

（1）以國內(nèi)3個(gè)公司生產(chǎn)的9批次乙腦減毒活疫苗為樣品進(jìn)行檢測(cè)。每批次疫苗接種BSC-1細(xì)胞2瓶。同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照2瓶，Reo3毒種2瓶。37℃吸附1.5 h，棄掉吸附的檢品液體，加入細(xì)胞維持液，每d觀察細(xì)胞形態(tài)，每3～4d換液一次，并記錄結(jié)果。

（2）9批次疫苗接種BSC-1細(xì)胞，盲傳3代。每代細(xì)胞進(jìn)行滴片，分別與1∶10的陰、陽血清進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)。同時(shí)用已知病毒抗原片作陽性和陰性對(duì)照。

（3）選擇2010年國內(nèi)6個(gè)不同廠家送檢的鼠源性單克隆抗體細(xì)胞株10批次，分別接種BSC-1細(xì)胞，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照2瓶，Reo3毒種2瓶。每天觀察細(xì)胞病變情況，并記錄結(jié)果。盲傳2代后的細(xì)胞滴片，分別與小鼠陰、陽血清進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)［8］。

2 結(jié)果

2.1 敏感細(xì)胞的篩選

BHK21細(xì)胞和BSC-1細(xì)胞接種Reo3 48h后，均有70％～90％細(xì)胞出現(xiàn)CPE，病毒感染力滴度分別為10-5.3/mL和10-5.8/mL。選擇BSC-1細(xì)胞為Reo3培養(yǎng)細(xì)胞。

2.2 Reo3陽性血清與陰性血清的制備

制備免疫用抗原測(cè)蛋白濃度為5.1mg/mL。制備陽性對(duì)照（免疫血清及腹水A＞1.0）共15.0mL。制備陰性對(duì)照血清12.7mL。

2.3 羊抗小鼠IgG-FITC最佳工作濃度的確定（表1）。

滴定結(jié)果顯示當(dāng)FITC為1∶100時(shí)正常細(xì)胞孔與陰、陽對(duì)照血清反應(yīng)均無綠色熒光，也未觀察到熒光背景干擾；Reo3感染細(xì)胞孔與陰性對(duì)照血清反應(yīng)無綠色熒光，與陽性對(duì)照血清反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)綠色熒光（圖1、2見封二）。

2.4 敏感性試驗(yàn)

抗體檢測(cè)最大稀釋比例為1：1280；檢測(cè)病毒滴度最低為10-4.7/mL。

2.5 特異性試驗(yàn)

用已建立IFA法檢測(cè)小鼠鼠痘（Ect）病毒、和小鼠肝炎（MHV）病毒陽性血清，結(jié)果均為陰性。Reo3陰性對(duì)照和陽性對(duì)照與小鼠鼠痘（Ect）病毒感染的BHK21細(xì)胞均無交叉免疫熒光反應(yīng)。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

3個(gè)不同批次抗原片同時(shí)對(duì)小鼠陰、陽性血清從1：10～1：5120進(jìn)行檢測(cè)，和同1批次抗原片于-20℃保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月三個(gè)不同時(shí)間對(duì)小鼠陽性血清從1：10～1：5120進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均一致，檢測(cè)靈敏度均為1：1280。

2.7 應(yīng)用

2.7.1 動(dòng)物抗體的檢測(cè)：IFA法檢測(cè)60份小鼠血清，有4份抗體陽性，56份抗體陰性。

表1 熒光素工作濃度滴定結(jié)果Tab.1 Titration results of the IgG-FITC

2.7.2 細(xì)胞接種和免疫熒光試驗(yàn)：（1）細(xì)胞接種試驗(yàn)顯示，2瓶BSC-1細(xì)胞對(duì)照連續(xù)觀察無CPE產(chǎn)生（圖3），Reo3毒種使BSC-1細(xì)胞發(fā)生明顯CPE，（圖4）；9批次樣品接種的3代BSC-1細(xì)胞均未發(fā)生CPE，檢測(cè)結(jié)果均為陰性（圖3，4見封二）。（2）在陰陽對(duì)照成立的情況下，9批次樣品接種3代BSC-1細(xì)胞涂片與小鼠陰性血清及陽性血清均無綠色熒光反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。（3）細(xì)胞接種試驗(yàn)顯示在正常細(xì)胞對(duì)照成立的情況下，10批次鼠源性單克隆抗體細(xì)胞株接種BSC-1細(xì)胞，均無CPE產(chǎn)生；免疫熒光試驗(yàn)顯示，在陰、陽對(duì)照成立的情況下，10批次單克隆抗體細(xì)胞株接種BSC-1細(xì)胞涂片與小鼠陰性血清及陽性血清均無綠色熒光反應(yīng)，結(jié)果均為陰性。

3 討論

敏感性試驗(yàn)顯示抗體檢測(cè)最大稀釋比例為1∶1280；檢測(cè)病毒滴度最低為10-4.7/mL；特異性試驗(yàn)顯示與小鼠易感的其他病毒無交叉反應(yīng)；穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示不同批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)檢測(cè)靈敏度一致，均為1∶1280。說明本試驗(yàn)建立IFA法敏感性、穩(wěn)定性好，特異性強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)BSC-1細(xì)胞感染Reo3后，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多、細(xì)胞腫大、脫落、折光度增加，與Reo3的致細(xì)胞病變效應(yīng)一致（圖4），且Reo3陽性血清的檢測(cè)結(jié)果為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光反應(yīng)，為IFA檢測(cè)中抗原抗體相結(jié)合的陽性表現(xiàn)（圖2）；Reo3陰性血清的IFA檢測(cè)結(jié)果為紅色細(xì)胞，未見綠色熒光，為典型的IFA檢測(cè)陰性表現(xiàn)（圖1）；說明所建立的Reo3的IFA法效果較好［10］。

本試驗(yàn)同時(shí)用本室建立的ELISA法對(duì)上述IFA檢測(cè)的60份小鼠血清進(jìn)行Reo3抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示IFA法檢測(cè)抗體陽性的4份血清用ELISA法檢測(cè)，結(jié)果均為陽性；IFA法檢測(cè)抗體陰性的56份血清用ELISA法檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，2種方法檢測(cè)符合率為100％。

用細(xì)胞接種和免疫熒光試驗(yàn)相結(jié)合檢測(cè)9批次乙腦減毒活疫苗，3代BSC-1細(xì)胞均未發(fā)生CPE，3代細(xì)胞滴片分別與Reo3陰、陽對(duì)照血進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)，均為陰性。說明9批次疫苗均未被Reo3活毒感染。保證了疫苗使用的安全性。

同時(shí)用建立的IFA法檢測(cè)了2010年國內(nèi)6個(gè)廠家送檢的鼠源性單抗細(xì)胞株10批次，結(jié)果顯示均為陰性。與本室做的動(dòng)物安全試驗(yàn)、動(dòng)物抗體產(chǎn)生試驗(yàn)、雞胚接種和血凝試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果一致，也說明了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

本試驗(yàn)通過篩選，確定了Reo3敏感細(xì)胞，并滴了抗原片，為以后建立如大鼠、地鼠、等其他動(dòng)物Reo3 IFA檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)建立IFA法具有操作簡便、快速、敏感、特異等特點(diǎn)［11］，利用細(xì)胞接種和免疫熒光相結(jié)合的檢測(cè)方法具有穩(wěn)定性好、檢測(cè)結(jié)果可靠等特點(diǎn)，可應(yīng)用于動(dòng)物源性生物材料及生物制品外源Reo3的檢測(cè)。

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