李瑞生，李曉娟，高 蓉，白云峰，鮑龍濤，戰(zhàn)大偉

（1.解放軍第302醫(yī)院動物實驗中心，北京 100039；2.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院實驗動物科，北京 100048）

獼猴是國家二級保護(hù)動物，在獼猴屬中共有12個種46個亞種，其中食蟹猴主要分布在泰國、老撾、柬埔寨和緬甸北部等國家的熱帶雨林地區(qū)［1］，而國內(nèi)主要是通過人工飼養(yǎng)、馴化和繁殖，建立了人工生產(chǎn)繁殖種群。獼猴在生物進(jìn)化上與人類的遺傳物質(zhì)有98.5％的同源性，其組織結(jié)構(gòu)，生理代謝等功能與人類比較相似成為了最接近的實驗動物，在生命科學(xué)以及其它相關(guān)學(xué)科研究中占據(jù)其它實驗動物無法替代的重要位置［2，3］。目前應(yīng)用于實驗動物研究的獼猴主要是恒河猴，隨著實驗需求量的不斷增加，恒河猴種群數(shù)量已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足日益增長的實驗需求，而食蟹猴遺傳背景特性研究又甚少，其生理、生化指標(biāo)及遺傳概貌特點還不十分清楚，研究掌握食蟹猴種群的遺傳背景特性對大量應(yīng)用食蟹猴進(jìn)行各種實驗研究具有十分重要的意義。因此，本實驗利用所選取的100個微衛(wèi)星DNA位點對食蟹猴種群進(jìn)行了DNA多態(tài)性分析和遺傳監(jiān)測，了解食蟹猴種群的遺傳背景特性，為今后建立食蟹猴種群資源庫和遺傳質(zhì)量監(jiān)測方法提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

食蟹猴來源于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心自行繁殖的種群，隨機(jī)抽取成年猴50只，雌雄各半，體重為1.5～3kg，年齡為2～4歲，具有實驗動物質(zhì)量合格證書（SCXK（軍）-2007-004）。股靜脈采血提取DNA，-20℃保存。

1.2 引物設(shè)計與合成

選取100個具有多態(tài)性高、等位基因數(shù)多和分布廣的獼猴微衛(wèi)星DNA位點，引物序列均來自Genbank和文獻(xiàn)［4，5］，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.3 實驗方法

利用血液提取基因組DNA作為模板，每個PCR擴(kuò)增體系為25μL，35個循環(huán)，10μL擴(kuò)增產(chǎn)物行8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠于固定液中固定20min，硝酸銀染色30min，用無水碳酸鈉顯色，條帶清晰后，用10％乙酸終止，最后用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行凝膠成像，并對圖帶進(jìn)行相關(guān)分析。

1.4 統(tǒng)計分析

用BioRad凝膠成像系統(tǒng)對8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖帶結(jié)果進(jìn)行分析，確定其核酸條帶的分子量大小，然后再利用POPGEN32軟件計算基因頻率（gene frequency）、觀察等位基因數(shù)（observed number of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，Ne）、基因多樣性（gene diversity，H）和香隆信息指數(shù)（Shannon’s information index，I）［6］。

2 結(jié)果

2.1 根據(jù)等位基因數(shù)目篩選出20個多態(tài)性高的微衛(wèi)星DNA位點

利用100個微衛(wèi)星DNA位點對50只食蟹猴進(jìn)行了DNA多態(tài)性分析，根據(jù)監(jiān)測結(jié)果其等位基因數(shù)目的分布情況，從中篩選出20個等位基因數(shù)目在5條以上的微衛(wèi)星DNA位點，并通過對比實驗確定了各位點PCR擴(kuò)增最佳退火溫度、Mg2+濃度和圖帶片斷大小的范圍值，各位點的具體情況（表1）。

表1 20個食蟹猴多態(tài)性微衛(wèi)星DNA位點Tab.1 20 polymorphic microsatellite DNA loci in Macaca mulatta

圖1 D18S536位點擴(kuò)增的DNA圖譜注：1-14為1號至14號食蟹猴個體Fig.1 DNA mapping of amplification of D18S536 locusNote：1-14：individuals of Macaca fascicularis

2.2 食蟹猴種群不同個體間DNA多態(tài)性的分析

利用篩選出的20個多態(tài)性微衛(wèi)星DNA位點對食蟹猴種群進(jìn)行了DNA多態(tài)性分析，結(jié)果20個微衛(wèi)星DNA位點均具有顯著多態(tài)性，等位基因數(shù)最少達(dá)到5條，最多為10條，這些多態(tài)性位點能夠進(jìn)行個體間DNA多態(tài)性分析，并能較好地反映出群體的遺傳概貌（圖1）。

2.3 食蟹猴種群雌雄不同個體間多態(tài)性的統(tǒng)計分析

利用POPGEN32軟件計算雌雄個體其觀察等位基因數(shù)（observed number of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，Ne）、基因多樣性（gene diversity，H）和香隆信息指數(shù)（Shannon’s information index，I），其分析結(jié)果（表2），其中雌雄個體間差異無顯著性。

3 討論

表2 雌雄個體觀察等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣性（H）和香隆信息指數(shù)（I）的對比Tab.2 Observed number of alleles（Na），effective number of alleles（Ne），gene diversity（H），Shannon’s information index（I）between male and female Macaca fascicularis

獼猴在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)等領(lǐng)域的實驗研究中起到了非常關(guān)鍵性的作用，近年來國內(nèi)外學(xué)者利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)對常用實驗動物近交系大小鼠、家兔、犬和恒河猴進(jìn)行了大量的實驗研究［7-9］，目前微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)已在近交系大、小鼠遺傳質(zhì)量監(jiān)測中得到了有效的應(yīng)用，在法醫(yī)鑒定和人類的親子鑒定中也同樣得到了證實，可有效地運用于種群和個體間的等位基因、基因配型、親子鑒定和遺傳距離分析，使微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)得到了迅猛的發(fā)展，目前已被廣泛地應(yīng)用到實驗動物的遺傳質(zhì)量監(jiān)測研究中。Kanthaswamy S等［10-12］利用14個短串聯(lián)重復(fù)位點（STRs）對加州國立靈長類研究中心的3種不同飼養(yǎng)類型的3382只具有遺傳特征的純種獼猴動物進(jìn)行了遺傳組成分析，同時利用13個STRs對亞洲食蟹猴、東南亞本土與島國長尾食蟹猴（M.fascicularis）種群內(nèi)以及種群間的遺傳差異進(jìn)行了評估。Flynn S［13］等對食蟹猴和長尾食蟹猴（Macaca fascicularis）TNF-α啟動子的遺傳變異性以及瘧疾敏感性進(jìn)行了分析。李瑞生等［14］應(yīng)用微衛(wèi)星DNA位點對恒河猴種群進(jìn)行了DNA多態(tài)性分析，篩選出具有DNA多態(tài)性高的微衛(wèi)星DNA位點，分析了恒河猴種群的遺傳背景情況，證實了相同種群不同地區(qū)的恒河猴群體之間也存在差異。

本實驗所選的食蟹猴群體主要是來源于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心封閉繁殖5年以上的群體，沒有引入外來血緣，繁殖嚴(yán)格按照實驗動物的規(guī)定來進(jìn)行生產(chǎn)繁殖，該群體沒有出現(xiàn)遺傳污染。利用篩選的20個多態(tài)性微衛(wèi)星DNA位點對隨機(jī)抽取的50只食蟹猴進(jìn)行了DNA多態(tài)性和遺傳監(jiān)測分析，其等位基因數(shù)目都在5條以上，各位點均呈現(xiàn)顯著的DNA多態(tài)性，均能較好地反映出食蟹猴群體中不同個體間的DNA多態(tài)性分布情況，完全符合封閉群實驗動物的基本要求。因此，利用這些多態(tài)性微衛(wèi)星DNA位點可有效地分析食蟹猴群體的遺傳多樣性，為今后建立完整的食蟹猴遺傳背景資源庫，分析研究基因配型、親子鑒定及遺傳距離分析，指導(dǎo)食蟹猴的生產(chǎn)繁殖，建立血緣系譜明確、遺傳背景清楚的食蟹猴種群提供了理論依據(jù)。同時也為進(jìn)一步篩選食蟹猴與恒河猴種群間的特異性微衛(wèi)星DNA位點以及分析研究食蟹猴與恒河猴種群間遺傳背景差異特性提供了理論基礎(chǔ)。

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