盛小光 顧宏輝 趙振卿 虞慧芳 王建升 張曉輝

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，浙江 杭州 310021）

植物原生質(zhì)體一詞始自 Hanstein（1880），即指通過質(zhì)壁分離，能夠和細(xì)胞壁分開的那部分細(xì)胞物質(zhì)。按照細(xì)胞全能性學(xué)說，離體的植物原生質(zhì)體和其他起源的細(xì)胞一樣，在合適的離體培養(yǎng)條件下，具有繁殖、分化、再生成完整植株的能力。它的出現(xiàn)有力地促進(jìn)了與之相關(guān)領(lǐng)域科學(xué)研究的進(jìn)程，其在基礎(chǔ)研究及實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域具顯著優(yōu)勢。作為一種獨(dú)特?zé)o壁的單細(xì)胞體系，并且同一時(shí)間內(nèi)能得到遺傳上同質(zhì)的大量群體，為細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)，甚至病毒學(xué)建立了試驗(yàn)體系；同時(shí)在體細(xì)胞雜交、體細(xì)胞無性系變異篩選、遺傳轉(zhuǎn)化、種質(zhì)的超低溫保存等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。在農(nóng)業(yè)應(yīng)用尤其在作物品種改良方面，原生質(zhì)體全能性的順利表達(dá)是育種目的得以實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵和前提（趙大克 等，2009）。

Nagata和Takebe（1970）首次利用煙草葉片游離原生質(zhì)體，經(jīng)培養(yǎng)獲得再生植株，使原生質(zhì)體的研究和應(yīng)用進(jìn)入了一個(gè)新的階段。尤其是有關(guān)培養(yǎng)過程中供試材料的諸多生理特性的研究，為原生質(zhì)體培養(yǎng)提供了切實(shí)可行的理論依據(jù)，避免了培養(yǎng)過程中的盲目性，使原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)日臻完善。目前，至少有46科160多屬360多種植物（包括變種和亞種）的原生質(zhì)體再生體系得以建立（劉進(jìn)平，2005）。多種因素影響原生質(zhì)體全能性的實(shí)現(xiàn)，本文綜述了原生質(zhì)體游離、培養(yǎng)和再生過程中的影響因素及其在甘藍(lán)類蔬菜育種上的應(yīng)用。

1 原生質(zhì)體全能性表達(dá)

1.1 外植體來源及生理狀態(tài)

選用的材料在很大程度上影響原生質(zhì)體的游離效果。物種不同，則外植體的選擇也不同。

一般來說，雙子葉植物多選用葉片、下胚軸、子葉等器官作為游離材料。如擬南芥（Dovzhenko et al.，2003）、甘藍(lán)型油菜（Watanabe et al.，2002）等常用發(fā)芽5～7d的下胚軸或子葉，而煙草常用60～90d苗齡的新鮮葉片（Caboche，1980）；對(duì)于多數(shù)單子葉植物特別是禾本科植物來說，其原生質(zhì)體再生體系絕大部分均由幼穗、未成熟胚以及種子盾片等來誘導(dǎo)愈傷組織和懸浮細(xì)胞系所建立（Yamada et al.，1986）。如在小麥（Pauk et al.，1994）、百合（Famelaer et al.，1996）、水稻（Tang et al.，2001）、香蕉（Assani et al.，2002）等作物中，只有選用愈傷組織和懸浮細(xì)胞系游離的原生質(zhì)體才可以分裂、分化。

材料的生理狀況是影響原生質(zhì)體質(zhì)量的因素之一。生長季節(jié)、光照、肥水、滲透壓及溫度都顯著地影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量及活力。為調(diào)整材料的生理狀態(tài)，在原生質(zhì)體游離之前，對(duì)供體進(jìn)行預(yù)處理，有利于原生質(zhì)體的游離。如在 15～25 ℃室溫和自然光照下培養(yǎng)的甘藍(lán)無菌苗下胚軸游離原生質(zhì)體，原生質(zhì)體產(chǎn)量為 1×106個(gè)·g-1（FW），而經(jīng) 4 ℃低溫處理無菌苗，原生質(zhì)體的產(chǎn)量可增加1倍（Thomas & Elizabeth，1990）。Wallin和Welander（1985）把蘋果葉片放在附加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP），并添加0.5 μmol·L-1蛋氨酸的W5鹽-糖溶液中處理30min，原生質(zhì)體的產(chǎn)量明顯提高。

1.2 材料酶解

酶是影響原生質(zhì)體游離重要的因素之一，主要降解構(gòu)成植物細(xì)胞壁的纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)。不同植物種類或同一植物的不同器官以及它們的培養(yǎng)細(xì)胞，由于細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)組成不同，分解細(xì)胞壁所需的酶類也不同，而酶解處理就是要用合適的酶組合、最低的酶濃度和最短的酶解時(shí)間來獲得大量有活力的原生質(zhì)體。用于植物原生質(zhì)體分離的酶制劑基本上為纖維素酶和果膠酶，經(jīng)常搭配使用的酶類還有半纖維素酶、崩潰酶和蝸牛酶。一般而言，纖維素酶濃度為1 %～2 %，果膠酶濃度為0.5 %～1.0 %（Tautorus & Fowke，1991；孫振久和井立軍，2001）。酶解pH一般為5.5～5.8（Sinha et al.，2003）。酶解時(shí)間從幾小時(shí)到幾十小時(shí)不等，但一般以不超過24h為宜（Ochatt，1987）。

1.3 原生質(zhì)體的培養(yǎng)

獲得有活力的原生質(zhì)體后，在合適的培養(yǎng)條件下，可再生出新的細(xì)胞壁，進(jìn)而細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)分裂形成細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織，形成再生植株。但原生質(zhì)體能否培養(yǎng)成功受多種因素的影響。

1.3.1 培養(yǎng)方法 原生質(zhì)體培養(yǎng)方法和細(xì)胞培養(yǎng)類似，有液體淺層培養(yǎng)、固體包埋培養(yǎng)和固液結(jié)合培養(yǎng)。在這些培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上還衍生出了微（懸）滴培養(yǎng)、微型分離法培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、念珠培養(yǎng)、瓊脂島培養(yǎng)等。每一種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)目的和材料的不同選擇不同的培養(yǎng)方法。在六出花（Motonobu et al.，1997）、月季（Suk et al.，2003）、天竺葵（Nassour et al.，2003）等原生質(zhì)體培養(yǎng)中，液體培養(yǎng)基的效果優(yōu)于固體培養(yǎng)基。何龍飛等（1996）進(jìn)行普通白菜下胚軸原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，固液雙層法的效果最好，有利于改善通氣，滿足原生質(zhì)體發(fā)育所需營養(yǎng)，固相部分還可以吸附有害物質(zhì)，從而提高了原生質(zhì)體的分裂頻率。Pan等（2003，2004）研究表明，藥用植物藍(lán)刺頭（Echinops spinosissimus）葉肉原生質(zhì)體的培養(yǎng)采用瓊脂糖包埋培養(yǎng)較優(yōu)于液體淺層培養(yǎng)，具有更高的植板效率。

1.3.2 培養(yǎng)基 原生質(zhì)體的培養(yǎng)基多采用以 MS和 B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的改良培養(yǎng)基，如 KM8p和NT培養(yǎng)基等。一般pH值為5.6～5.8。實(shí)驗(yàn)證明糖是原生質(zhì)體培養(yǎng)中較理想的滲透壓穩(wěn)定劑和碳源，常用的有甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖。近年來，有研究表明某些去離子表面活性劑（如聚醚 F-68）及“氧載體”（如全氟化碳和血紅蛋白）的添加可以提高原生質(zhì)體的分裂頻率和植板效率，如在苦茄（Solanum dulcamara）的原生質(zhì)體培養(yǎng)基中添加終濃度為0.1 %（W/V）的聚醚F-68，可以將植板效率比對(duì)照提高26 %（Lowe et al.，2001）。水稻懸浮細(xì)胞游離的原生質(zhì)體培養(yǎng)中添加全氟化碳試劑后的植板效率比對(duì)照增加了5倍，并且這種促進(jìn)作用存在于整個(gè)培養(yǎng)階段，使最終的芽再生頻率也比對(duì)照提高了12 %（Lowe et al.，2003）。

原生質(zhì)體培養(yǎng)基中添加的激素種類主要有生長素類（常用的有萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、吲哚丙酸等），赤霉素類（常用的有赤霉酸）和細(xì)胞分裂素類（常用的有 6-芐基腺嘌呤、玉米素等）。不同植物原生質(zhì)體培養(yǎng)對(duì)激素的種類和濃度的要求存在很大的差異，通常認(rèn)為在原生質(zhì)體的前期培養(yǎng)中，需生長素來誘導(dǎo)分裂；而后期的分裂分化中，則是細(xì)胞分裂素起主導(dǎo)的作用（Dudits & Fehér，2000）。

1.3.3 培養(yǎng)密度 原生質(zhì)體培養(yǎng)的常規(guī)技術(shù)是群體培養(yǎng)，培養(yǎng)密度對(duì)細(xì)胞的生長十分重要，密度條件一般在5×103～5×105個(gè)·mL-1時(shí)，植物原生質(zhì)體才能正常分裂與發(fā)育（Davey et al.，2005）。密度過高時(shí)，由于營養(yǎng)不足或細(xì)胞代謝物過多而抑制再生細(xì)胞的正常生長；密度過低時(shí)，原生質(zhì)體再生細(xì)胞不能持續(xù)分裂，這可能是因?yàn)樵|(zhì)體在培養(yǎng)過程中，本身會(huì)釋放具有與分裂有關(guān)的物質(zhì)，原生質(zhì)體密度過低，這種物質(zhì)達(dá)不到一定的濃度而影響分裂（Horita et al.，2003）。Matsubayashi和Sakagami（1998）對(duì)蘆筍的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)原生質(zhì)體培養(yǎng)的濃度低于每毫升5×104個(gè)時(shí)，則培養(yǎng)細(xì)胞根本不分裂；而黃籽甘藍(lán)原生質(zhì)體培養(yǎng)的適宜密度為 6×103～6×104個(gè)·mL-1（李名揚(yáng)和羅金華，1995）。

1.4 原生質(zhì)體的再生

至今，雖然已有46科160多屬360多種植物（包括亞種、變種）的原生質(zhì)體成功地獲得了再生植株，但主要集中在茄科、傘形科、十字花科、菊科、豆科和禾本科的幾個(gè)屬（劉進(jìn)平，2005）。原生質(zhì)體植株再生途徑通常有 3條：經(jīng)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育形成愈傷組織，再分化成芽，進(jìn)而長成植株；直接形成胚狀體，再發(fā)育成植株；先形成愈傷組織，再由愈傷組織分化形成胚狀體，最后發(fā)育成植株。胚狀體途徑分化成苗，可以避免愈傷過程可能給分化帶來的困難，而且能更好地保持再生植株的遺傳穩(wěn)定性，避免愈傷化可能產(chǎn)生的倍性和染色體變異。目前只有蘆筍（Hisato & Masahiro，1990）、香蕉（Panis et al.，1993）等少數(shù)幾種植物是通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑再生成植株，多數(shù)植物還是先形成愈傷組織，然后分別誘導(dǎo)芽和根。

2 原生質(zhì)體全能性表達(dá)在甘藍(lán)類蔬菜育種上的應(yīng)用

甘藍(lán)（Brasscia oleracea L.）屬十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brasscia），包括結(jié)球甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、球莖甘藍(lán)、皺葉甘藍(lán)、花椰菜、青花菜、芥藍(lán)等多個(gè)變種，是普遍栽培的重要蔬菜作物（周慶紅 等，2003）。至今，原生質(zhì)體全能性表達(dá)及以此為基礎(chǔ)的體細(xì)胞雜交和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在甘藍(lán)類蔬菜作物育種中已得到較為廣泛的運(yùn)用。

2.1 利用原生質(zhì)體培養(yǎng)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化

目前甘藍(lán)外植體遺傳轉(zhuǎn)化主要以無菌苗的莖、芽、葉片、子葉、愈傷組織等為受體，取材容易，操作相對(duì)簡便，但由于受體多為多細(xì)胞系統(tǒng)，所形成的轉(zhuǎn)化植株多為嵌合體，這給目標(biāo)性狀的純化和穩(wěn)定遺傳帶來一定的困難。而原生質(zhì)體是單細(xì)胞系統(tǒng)，沒有或較少受周圍細(xì)胞和微環(huán)境的影響，再生的植株也是由單細(xì)胞發(fā)育而來，性狀易純化且穩(wěn)定遺傳。所以向原生質(zhì)體導(dǎo)入外源基因比向其他外植體導(dǎo)入外源基因有更大的優(yōu)勢。另一方面，由于原生質(zhì)體去除了細(xì)胞壁的保護(hù)，可避免核酸酶對(duì)異體DNA的破壞，原生質(zhì)體較易從外界攝入病毒、細(xì)菌、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)、核酸等，使得外源基因容易導(dǎo)入（Rakoczy-Trojanowska，2002），因此利用原生質(zhì)體導(dǎo)入外源基因?qū)楦仕{(lán)類蔬菜的基因轉(zhuǎn)化帶來一條新的途徑。Mukhopadhyal等（1991）報(bào)道甘藍(lán)下胚軸原生質(zhì)體在聚乙二醇（PEG）的介導(dǎo)下，直接攝取了抗潮霉素（Hygromgcin）的標(biāo)記基因的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化頻率10 %～33 %，而且獲得了轉(zhuǎn)化再生植株。楊仲南和許智宏（1994）通過PEG介導(dǎo)研究了外源GUS基因在花椰菜原生質(zhì)體中的瞬間表達(dá)。薛紅衛(wèi)和衛(wèi)志明（1996）將GUS基因?qū)敫仕{(lán)下胚軸原生質(zhì)體并獲得轉(zhuǎn)基因植株。Eimert（1992）用花椰菜葉肉原生質(zhì)體，通過電激法轉(zhuǎn)化得到了抗性芽。Radchuk等（2002）也利用花椰菜葉肉原生質(zhì)體為受體，通過PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法獲得了轉(zhuǎn)基因陽性植株。

2.2 利用原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得無性系變異

由于原生質(zhì)體無細(xì)胞壁，它對(duì)培養(yǎng)體系中理化因素的影響更為直接和敏感，且在培養(yǎng)條件下的代謝過程與在植株體內(nèi)并不完全相同，所以在原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中容易產(chǎn)生無性系的變異，這些變異植株已廣泛應(yīng)用于育種工作中。首先，產(chǎn)生的變異為選擇新優(yōu)材料提供了可能，為品種選育提供了材料；其次，由于原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株變異是在培養(yǎng)過程中發(fā)生的，不需經(jīng)過其他特殊的操作和選擇。因此，能夠縮短育種年限，節(jié)約時(shí)間，加速育種進(jìn)程；第三，在現(xiàn)有研究條件下，通過酶解法能夠分離得到大量的原生質(zhì)體，使得變異發(fā)生面廣、幅度大、整齊度高而且穩(wěn)定快，因而可以獲得大量的變異材料。熊新生等（1988）在甘藍(lán)原生質(zhì)體再生植株中發(fā)現(xiàn)了二倍體、四倍體，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)部分非整倍體。Sheng等（2011）在花椰菜下胚軸原生質(zhì)體的再生植株中也發(fā)現(xiàn)了少量的四倍體和六倍體。

2.3 利用體細(xì)胞雜交創(chuàng)造新的遺傳變異

通過體細(xì)胞雜交產(chǎn)生體細(xì)胞雜種，為植物育種提供了一條克服生殖隔離，提高變異的新途徑。體細(xì)胞雜交可以在親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)的物種間或者在栽培種與野生種之間進(jìn)行，并且細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核基因同時(shí)參與雜交，經(jīng)過進(jìn)一步選擇、回交，甚至繼續(xù)進(jìn)行體細(xì)胞雜交，不僅有希望得到蔬菜新類型，還能夠豐富蔬菜種質(zhì)資源。至今，通過原生質(zhì)體融合已成功獲得甘藍(lán)（B.oleracea）與蕓薹（B. campestris）（Jourdan et al.，1989；Yamashita et al.，1989）、普通白菜（B. napus）（Yarrow et al.，1990）、蕪菁（B. rapa）（Cardi & Earle，1997）、芥菜（B. juncea）（Arumugam et al.，2000）、Brassica spinescens（姚星偉 等，2005）、黑芥（B. nigra）（張麗 等，2008）等蕓薹屬內(nèi)及甘藍(lán)與Moricandia arvensis（Toriyama et al.，1987）、Moricandia nitens（Yan et al.，1999）、白芥（Sinapis alba）（Hansen & Earle，1997）、亞麻薺（Camelina sativa）（Hansen，1998）、紫羅蘭（Matthiola incana）（Sheng et al.，2008）等屬間的體細(xì)胞雜種植株，這些種間和屬間雜種為甘藍(lán)品種改良提供了十分豐富的變異類型和橋梁材料。

2.4 利用體細(xì)胞雜交創(chuàng)制雄性不育新種質(zhì)

在育種上雜種優(yōu)勢有極大的利用價(jià)值，而實(shí)現(xiàn)雜種優(yōu)勢育種的最簡便和有效方法就是利用雄性不育系。目前，大部分蔬菜采用的都是細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Cytoplasmicmale sterility，CMS）的不育系。甘藍(lán)中的雄性不育源多為 Ogura胞質(zhì)不育（又叫蘿卜胞質(zhì)不育）。一般來說，有三種途徑獲得CMS性狀：一是自發(fā)產(chǎn)生CMS性狀；二是種內(nèi)或種間有性雜交再回交，轉(zhuǎn)育CMS性狀；三是通過體細(xì)胞雜交獲得CMS性狀。自發(fā)產(chǎn)生CMS的頻率很低，且隨機(jī)性強(qiáng)，所以不方便利用。通過回交轉(zhuǎn)育CMS性狀在結(jié)球甘藍(lán)（方智遠(yuǎn) 等，2001；劉玉梅 等，2002）、花椰菜（陳文輝 等，2010）等作物中已經(jīng)有成功的例子。但所獲得的植株除了CMS特性以外，還常常伴有黃化、蜜腺發(fā)育不良、花形態(tài)異常和結(jié)實(shí)率低等異?，F(xiàn)象。相關(guān)專家認(rèn)為這些現(xiàn)象是異源細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間的不協(xié)調(diào)或者是異源親本葉綠體的不協(xié)調(diào)引起雜種細(xì)胞內(nèi)的葉綠素缺失造成的。這些說法都涉及到細(xì)胞質(zhì)，所以用有性雜交的方法難以彌補(bǔ)。通過體細(xì)胞雜交途徑進(jìn)行品種間或物種間cmS性狀的轉(zhuǎn)移，則很少發(fā)生上述異常現(xiàn)象。Kao等（1992）通過原生質(zhì)體融合，獲得了具雄性不育的Ogura線粒體、青花菜葉綠體和細(xì)胞核的胞質(zhì)雜種，這種胞質(zhì)雜種雄性不育材料在低溫下不黃化，可用于F1種子生產(chǎn)?；葜久鞯龋?006）應(yīng)用非對(duì)稱體細(xì)胞雜交技術(shù)向花椰菜成功轉(zhuǎn)移了甘藍(lán)型油菜中的Ogura雄性不育胞質(zhì)。

除了依靠原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)移現(xiàn)有不育基因外，原生質(zhì)體融合本身也可以產(chǎn)生不育的融合雜種。Kanno等（1997）利用非對(duì)稱體細(xì)胞雜交技術(shù)創(chuàng)造了具有CMS性狀的甘藍(lán)與蘿卜的屬間體細(xì)胞雜種，為了驗(yàn)證CMS產(chǎn)生的機(jī)理，詳細(xì)分析了雜種葉綠體和線粒體的基因組，認(rèn)為可能是親本的線粒體DNA發(fā)生重組產(chǎn)生嵌合體所致，也可能是正常的線粒體基因轉(zhuǎn)綠受阻引起的，同時(shí)也不排除由細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)不協(xié)調(diào)造成的。Motegi等（2003）應(yīng)用可育的甘藍(lán)和可育的蘿卜，通過非對(duì)稱原生質(zhì)體融合獲得了CMS甘藍(lán)，而且該CMS甘藍(lán)與紫甘藍(lán)回交9次仍表現(xiàn)不育性。 RFLP分析表明，該不育品系的mtDNA與OguraCMS型存在高度的結(jié)構(gòu)相似性。

2.5 利用體細(xì)胞雜交創(chuàng)制抗病（蟲）新種質(zhì)

甘藍(lán)類蔬菜在生產(chǎn)、貯藏和運(yùn)輸中一直受到各種病蟲害的威脅，如黑斑病、根腫病、黑腐病和蚜蟲等，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。甘藍(lán)的抗?。ㄏx）性大多是由多基因控制的數(shù)量遺傳性狀，而且在甘藍(lán)栽培種或其沒有生殖隔離的植物中很難找到抗源，即使個(gè)別品種有一定的抗性，其抗性水平也比較低。但在甘藍(lán)野生種中常常有很好的抗源，傳統(tǒng)的育種方法克服不了有性雜交的不親和性，因此很難利用這些野生植物中的抗源。體細(xì)胞雜交特別是非對(duì)稱體細(xì)胞雜交技術(shù)為甘藍(lán)類蔬菜抗病（蟲）育種提供了一條克服生殖障礙，縮短育種年限的捷徑。Hagimori 等（1992）利用體細(xì)胞雜交技術(shù)成功將蘿卜中的根腫病抗源轉(zhuǎn)移到花椰菜中，雜種的抗性與親本蘿卜基本一致。Hansen等（1997，1998）、Sigareva和Earle（1999）用不抗黑斑病的甘藍(lán)分別與對(duì)黑斑病高抗的野生植物歐白芥（Sinapis alba L.）和亞麻芥（Camelina sativa L.）進(jìn)行體細(xì)胞雜交。在所獲得的體細(xì)胞雜種中均有對(duì)黑斑病高抗的個(gè)體，從而證明已將野生植物中對(duì)黑斑病的抗性轉(zhuǎn)入甘藍(lán)。張麗等（2008）和Wang等（2011）利用非對(duì)稱體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得了大量花椰菜和黑芥的體細(xì)胞雜種，并成功將野生種質(zhì)黑芥中的黑腐病抗性轉(zhuǎn)入栽培種花椰菜中。

體細(xì)胞雜交在甘藍(lán)類蔬菜抗蟲育種方面的應(yīng)用雖然不多，但也有一些成功的例子。如姚星偉等（2005）和 Sheng等（2008）利用體細(xì)胞雜交技術(shù)向栽培種花椰菜中分別轉(zhuǎn)移了野生種質(zhì)Brassica spinescens和紫羅蘭的蚜蟲抗性。

3 展望

甘藍(lán)類蔬菜是蕓薹屬作物中原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)研究最為活躍的領(lǐng)域。近年來，甘藍(lán)類蔬菜原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生技術(shù)不斷完善，體細(xì)胞融合技術(shù)特別是非對(duì)稱細(xì)胞融合技術(shù)日趨成熟，為甘藍(lán)類蔬菜作物種間雜交和雄性不育等細(xì)胞質(zhì)基因的轉(zhuǎn)育提供了技術(shù)保障，但是利用原生質(zhì)體技術(shù)改良甘藍(lán)類蔬菜的遺傳性狀并將之運(yùn)用于生產(chǎn)實(shí)踐中還有很大距離。原生質(zhì)體技術(shù)本身也還存在著很多問題：①原生質(zhì)體培養(yǎng)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性差，存在很強(qiáng)的經(jīng)驗(yàn)性。同時(shí)，原生質(zhì)體再生植株頻率較低，存在很強(qiáng)的親本基因型限制，而原生質(zhì)體植株再生的難易會(huì)直接影響體細(xì)胞雜交育種的成敗。②誘導(dǎo)融合過程中的許多因素如誘導(dǎo)物質(zhì)的使用、融合方法的選擇等會(huì)直接影響到原生質(zhì)體的活力和融合率，從而影響細(xì)胞雜交的效率。③體細(xì)胞雜種特別是非對(duì)稱體細(xì)胞雜種，其本身染色體數(shù)目不定，染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，以及異常的減數(shù)分裂等造成雜種不育或育性極差的問題。

面對(duì)以上實(shí)際問題，今后的工作要加強(qiáng)原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)的理論基礎(chǔ)研究，將細(xì)胞工程和分子生物學(xué)手段相結(jié)合，找出問題背后的相關(guān)調(diào)控機(jī)制，為改善和解決相關(guān)問題提供理論依據(jù)。今后應(yīng)重點(diǎn)在以下幾個(gè)方面開展工作：①加強(qiáng)對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合過程中的細(xì)胞遺傳學(xué)研究，比如核質(zhì)關(guān)系、不親和性、細(xì)胞分裂的調(diào)控及細(xì)胞全能性表達(dá)和受阻的機(jī)理、遺傳物質(zhì)的重組等，進(jìn)一步從理論上解決原生質(zhì)體全能性表達(dá)的親本基因型限制及原生質(zhì)體融合雜種植株再生頻率低的問題。②加強(qiáng)對(duì)再生雜種植株的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)研究，特別是與育性相關(guān)的基因調(diào)控機(jī)制，為解決雜種育性極低或不育問題提供理論依據(jù)。③加強(qiáng)以原生質(zhì)體為受體的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究，為改良甘藍(lán)類蔬菜作物品質(zhì)、抗逆性、產(chǎn)量等性狀提供一條新的途徑。

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