楊淑榮， 王延麗， 謝昌平， 李超萍， 張科立

（海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，儋州 571737）

加那利海棗葉斑病病原鑒定＊

楊淑榮， 王延麗， 謝昌平＊＊， 李超萍， 張科立

（海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，儋州 571737）

對(duì)加那利海棗葉斑病的癥狀進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明，加那利海棗葉斑病主要發(fā)生在葉片和葉柄。初期癥狀是在葉片和葉柄出現(xiàn)水漬狀褪綠色的褐色小點(diǎn)，病斑擴(kuò)大成淺褐色橢圓形或不規(guī)則病斑，病斑周圍有黃色的暈圈，后期變褐色至灰褐色，中央產(chǎn)生小黑點(diǎn)。按照柯赫氏法則對(duì)該病害的病原菌進(jìn)行分離和致病性測(cè)定。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS序列分析鑒定，將病原菌鑒定為異色擬盤多毛孢［Pestalotiopsis versicolor（Speg.）Steyaert］。

加那利海棗； 葉斑病； 異色擬盤多毛孢； rDNA-ITS； 鑒定

＊ 致 謝： 在試驗(yàn)過(guò)程中，廣西大學(xué)韋繼光教授對(duì)病原菌鑒定給予幫助，中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所黃貴修研究員、時(shí)濤助理研究員和劉先寶助理研究員在分子鑒定方面給予大力幫助，謹(jǐn)表衷心感謝！

＊＊ 通信作者 Tel：0898-23306796；E-mail：xiechangping002＠sina.com

加那利海棗（Phoenix canariensis）屬棕櫚科，刺葵屬，別名長(zhǎng)葉刺葵、針葵和檳榔竹等。是一種極具熱帶風(fēng)情的觀賞棕櫚植物，廣泛應(yīng)用于公園造景和行道綠化，也可作室內(nèi)觀賞，是世界著名的高級(jí)風(fēng)景樹(shù)種之一［1－2］。近年來(lái)隨著城市綠化，加那利海棗的栽培數(shù)量逐漸增加。2006年7－10月，筆者在海南省儋州市南湖公園和中心花圃內(nèi)的加那利海棗葉片和葉柄上發(fā)現(xiàn)一種病害，田間發(fā)病率高達(dá)85%～90%。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)加那利海棗葉斑病有關(guān)報(bào)道較少。羅金水等［3］報(bào)道福建省加那利海棗苗圃中發(fā)生的褐斑病是由柯氏帚梗柱孢霉（Cylindrocladium colhouniiPeerally）引起的。金亮等［4］報(bào)道廈門地區(qū)加那利海棗葉斑病由掌狀擬盤多毛孢（Pestalotiopsis palmarumCooke.）引起，但僅危害葉片，不危害葉柄，且病原菌的鑒定僅通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定。筆者通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，加那利海棗葉斑病菌與金亮等［4］的掌狀擬盤多毛孢有較大的差異。張家祥和葛起新等詳細(xì)報(bào)道在加那利海棗上分離出擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsisspp.）真菌，分別為異色擬盤多毛孢［P.versicolor（Speg.）Steyaert］和韋司梅擬盤多毛孢［P.vismiae（Petr.）Zhang et Xu Comb.nov.］，并對(duì)病原菌的孢子形態(tài)和大小及培養(yǎng)性狀作了描述［5－6］。為了明確引起加那利海棗葉斑病的病原，筆者對(duì)海南省儋州市加那利海棗葉斑病的病原菌進(jìn)行了分離和鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料來(lái)源

材料采自海南省儋州市南湖公園內(nèi)的加那利海棗上發(fā)病典型的葉片和葉柄。

1.2 癥狀描述

按常規(guī)方法對(duì)田間病株出現(xiàn)的癥狀進(jìn)行描述，并拍攝病害的癥狀。

1.3 菌株的分離與純化

采用常規(guī)組織分離方法［7］，從發(fā)病部位的病健交界處切取大小約4～5mm的組織塊，用70%乙醇消毒數(shù)秒后，用0.1%升汞表面消毒1min，無(wú)菌水沖洗3次，放置在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，觀察分離菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢情況，將葉片和葉柄上分離所得的病原菌分別標(biāo)記為P1和P2菌株。采用瓊脂平板稀釋純化法進(jìn)行純化［7］。

1.4 菌株的致病性測(cè)定

將純化、產(chǎn)孢的病原菌P1、P2菌株用無(wú)菌水配制成50～60個(gè)分生孢子（10×20倍）的孢子懸浮液，田間噴灑在同一品種健康寄主植株的葉片和葉柄上，以無(wú)菌水作為對(duì)照；接種后保濕，觀察并記錄發(fā)病情況。

1.5 病原菌形態(tài)觀察

將純化的菌株分別接種在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5d后，觀察菌落顏色、形狀、大小及產(chǎn)孢情況，后挑取病原菌，制臨時(shí)玻片，鏡檢并觀察分生孢子的顏色、形態(tài)和大小。

1.6 病原菌核糖體DNA-ITS序列的PCR擴(kuò)增和分析

1.6.1 基因組DNA的提取

采用 CTAB提取總 DNA［8］。

1.6.2 病原菌核糖體DNA-ITS序列擴(kuò)增

（1）通用引物：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

（2）PCR反應(yīng)體系：ddH2O 19μL；10×Buffer 2.5μL；dNTP（2.5mmol／L）0.7μL；ITS1（10pmol／L）1μL；ITS4（10pmol／L）1μL；TaqDNA聚合酶（2.5U／μL）0.3μL；模板 DNA（0.5ng／μL）0.5μL?？傮w積25μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性50s；60℃退火1min；72℃延伸1min；35個(gè)循環(huán)；72℃延伸完全10min。反應(yīng)完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6.3 病原菌核糖體DNA-ITS序列同源性比較

對(duì)測(cè)得的供試菌株核糖體DNA-ITS區(qū)段的序列，分別運(yùn)用GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST工具軟件，在DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索同源DNA序列并進(jìn)行比較分析，根據(jù)BLAST搜索和比較的結(jié)果，進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀

葉斑病主要危害葉片和葉柄。發(fā)病初期在葉片上出現(xiàn)水漬狀褪綠色的褐色小點(diǎn)，病斑擴(kuò)展成淺褐色橢圓形或不規(guī)則形小斑，病斑大小為1～3mm，病斑周圍有黃色的暈圈；隨病斑的進(jìn)一步擴(kuò)大，病斑周圍出現(xiàn)輪紋，多個(gè)病斑愈合成不規(guī)則形的大斑，病斑中央呈黑褐色，邊緣顏色成深褐色，在病斑中央散生許多小黑點(diǎn)，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)整葉干枯（圖1a）。

葉柄上發(fā)病多從帶刺部位先發(fā)病，初期在植株葉柄上出現(xiàn)水漬的褐色小斑點(diǎn)，中期小斑點(diǎn)變?yōu)榧t褐色至黑褐色長(zhǎng)條形病斑，并且不斷地?cái)U(kuò)大，后期幾個(gè)病斑擴(kuò)大連成一片，形成大病斑，病部表皮皺縮，中央凹陷，嚴(yán)重時(shí)造成整個(gè)葉柄干枯（圖1b）。

2.2 病原菌的致病性

接種15d后，用孢子懸浮液接種的葉片和葉柄均發(fā)病，所產(chǎn)生的癥狀與田間自然發(fā)病的癥狀相同，并從接種發(fā)病的病斑上重新分離到相同的病原菌。而對(duì)照葉片和葉柄均不發(fā)?。▓D1c）。

2.3 病原菌的形態(tài)

該病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌落圓形，邊緣不平滑，菌絲白色絮狀，孢子堆顏色呈墨汁色，排列比較稀疏，菌絲層分布均勻，無(wú)輪紋；背面具淡橘黃色的色素；在28℃的光照條件下有分布不均勻的黑色斑點(diǎn)，無(wú)明顯輪紋，10d后在菌落表明產(chǎn)生黑色的分生孢子堆（圖1d）。分生孢子長(zhǎng)梭形，有的稍微彎曲，4隔5胞，分生孢子大小為：（21.1～32.0）（27.0）μm×（6.5～11.2）（8.6）μm；中間3個(gè)細(xì)胞著色，上二色孢褐色至暗褐色，第三色胞顏色較淺，淡褐色，分隔處顏色加深；色胞長(zhǎng)（13.8～19.5）（16.9）μm；頂和尾孢均為三角形，無(wú)色透明，頂胞上著生無(wú)色附屬絲2～3根，長(zhǎng)（10.4～26.0）（16.2）μm，尾孢上著生一根基部附屬絲，中生，長(zhǎng)（3.9～9.1）（5.2）μm（圖1e）。分生孢子從第3個(gè)有色胞萌發(fā)，首先第三色胞膨大變圓形，顏色變淺，后從其一邊或兩邊同時(shí)萌發(fā)出芽管，芽管慢慢伸長(zhǎng)變成根狀的細(xì)管，隨著芽管的伸長(zhǎng)第三色胞逐漸收縮，整個(gè)細(xì)胞也會(huì)漸漸收縮（圖1f）。根據(jù)形態(tài)特點(diǎn)，查閱相關(guān)資料［5－6，9－10］初步 確定該 病 原 菌 為 有 絲 分 裂 孢 子 真 菌的腔孢綱（Coelomycetes）、黑盤孢目（Melanconia-les）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）、異色擬盤多毛孢［P.versicolor（Speg.）Steyaert］。

2.4 病原菌的rDNA-ITS分子鑒定

將擴(kuò)增片段經(jīng)克隆和測(cè)序的rDNA-ITS序列在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示：病原菌目的片段序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的異色擬盤多毛孢（P.versicolor）rDNA-ITS核苷酸序列（登錄號(hào)為AF405298）相似性達(dá)99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和rDNA-ITS序列對(duì)比分析，確定引起加那利海棗葉斑病的病原菌為異色擬盤多毛孢菌［P.versicolor（Speg.）Stey.］。

3 討論

對(duì)擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）種的鑒定，傳統(tǒng)的方法是采用寄主范圍、培養(yǎng)性狀和病原菌的形態(tài)學(xué)進(jìn)行。由于擬盤多毛孢菌的寄主范圍非常廣，因此，根據(jù)寄主范圍來(lái)確定種是不準(zhǔn)確的。培養(yǎng)性狀在不同轉(zhuǎn)代間穩(wěn)定性較差，但屬內(nèi)不同種之間差異確實(shí)存在，菌落形態(tài)顏色、菌落背面色素沉淀情況、背面輪紋的有無(wú)等在種間鑒定方面具有一定的參考價(jià)值。而病原菌形態(tài)學(xué)在鑒定中極為重要，特別是分生孢子頂端附屬絲的端部是否匙狀膨大是重要的形態(tài)特征，它能夠較穩(wěn)定地遺傳，并且在光學(xué)顯微鏡下比較明顯，因此，對(duì)該菌種鑒定有較大的參考作用。但對(duì)于多數(shù)擬盤多毛孢菌由于沒(méi)有匙狀膨大這一重要形態(tài)特征，并且各菌種間差異往往不明顯，所以僅憑形態(tài)學(xué)有時(shí)也難以確定種。由于rDNA-ITS區(qū)域種間存在著豐富的變異，而在種內(nèi)不同菌株間卻具高度保守性，常用于鑒定種和種內(nèi)新株系［11－12］。本研究結(jié)合病原菌培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)特征和rDNA-ITS序列分析，確定加那利海棗葉斑病菌為異色擬盤多毛孢菌［P.versicolor（Speg.）Steyaert］。

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Identification of the pathogen causing the leaf spot disease ofPhoenixcanariensis

Yang Shurong， Wang Yanli， Xie Changping， Li Chaoping， Zhang Keli
（1.College of Environmental and Plant Protection，Hainan University，Danzhou571737，China）

The symptoms of leaf spot ofPhoenix canariensiswere observed.The results showed that leaf spot ofP.canariensismainly occurred on leaves and petioles.The early symptom was brown lesion with water soaked and chlorotic leaves and petioles.Lesion expanded into brownish oval or irregular spots.The spots were surrounded by yellow helos and the spots changed into brown to grayish brown during the late stage.Centres of the spots produced black dots.According to Koch’postulates，the pathogens were isolated and pathogenicity was determined.Based on morphological characters and sequence of rDNA-ITS，the pathogen was identified asPestalotiopsis versicolor（Speg.）Steyaert.

Phoenix canariensis； leaf spot；Pestalotiopsis versicolor； rDNA-ITS； identification

S 436.8

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.05.027

2010-09-28

2010-12-02

海南省科技基金項(xiàng)目（No.Rnd0524）