李書鉞

(林同棪國際工程咨詢(中國)有限公司， 重慶 401121)

0 引 言

隨著現代經濟的快速發(fā)展，隨之也引發(fā)了一些負面影響，其中環(huán)境問題尤為嚴重，因此對污染物的毒性鑒定顯得十分重要.就此問題，分析工作者研究采用各種生物方法來檢測水質毒性，包括微生物、藻、底棲軟體動物、浮游生物、魚等，其中發(fā)光細菌因其獨特的生理發(fā)光特性以及與現代光電檢測手段完美結合的特點而得到了人們廣泛的關注.Hastings最先提出了發(fā)光細菌的發(fā)光機制，發(fā)光細菌在20世紀30年代首先用于快速評價藥物的毒性作用.1978年美國Beckman儀器公司研制了生物發(fā)光光度計，即Microtox系統(tǒng).目前，許多國家如加拿大、法國、意大利、美國已將發(fā)光細菌方法作為標準的毒性測試方法.采用發(fā)光細菌作為毒性測試的指標生物的生物毒性檢測儀，以其結果可靠、操作方法簡便和經濟耗費低等優(yōu)點已經成為水質毒性檢測研究的主要方向[1-3]，我國也于1995年將這一方法列為環(huán)境毒性檢測的標準方法( GB/T 15441-1995)[4].但是，由于受到發(fā)光細菌生長周期的限制，使得現場檢測與實際水質毒性存在較大的人為誤差，再者由于很多儀器敏感元件需要與毒性物質接觸，從而大大縮短了儀器使用壽命.本研究采用光纖傳導，以明亮發(fā)光桿菌為指示生物，將發(fā)光細菌制成生物膜組件，這樣可以使檢測系統(tǒng)與分析系統(tǒng)相分開，不僅能夠延長儀器的使用壽命，還能夠實現急性毒性的連續(xù)檢測，大大方便了發(fā)光細菌傳感器在現場的應用，也為研制在線檢測傳感器奠定了基礎.

1 發(fā)光細菌傳感器的原理及結構

1.1 發(fā)光細菌傳感器的原理

發(fā)光細菌通過其正常新陳代謝產生發(fā)光現象，在條件一定的情況下，發(fā)光較為穩(wěn)定，并且在有外在毒性物質存在的情況下，發(fā)光變化較為顯著.其代謝反應過程可以簡要概括為[5]：

FMNH2+RCHO→FMN+RCOOH+H2O+hv

該反應是在發(fā)光細菌細胞內由細菌熒光酶素催化，黃素單核苷酸(FMNH2)、長鏈脂肪酸(RCHO)、氧氣(O2)發(fā)生反應，產生波長約為480 nm的藍綠光.當發(fā)光細菌與外來毒性物質接觸一段時間后，其發(fā)光強度有明顯的變化.通常情況下，發(fā)光細菌的發(fā)光強度與毒性物質的毒性大小呈負相關的關系.Thomulka 認為,外來受試物通過下面兩個途徑抑制細菌發(fā)光: (1) 外在毒物直接抑制發(fā)光反應酶活性，從而影響代謝反應；(2) 外在毒物通過抑制細胞內與發(fā)光反應有關的其他代謝過程(如細胞呼吸等)間接影響發(fā)光代謝反應[6].基于以上原理，利用發(fā)光細菌的發(fā)光強度與毒性物質的毒性大小呈負相關的關系，可以研制檢測水質毒性的發(fā)光細菌傳感器.

1.2 發(fā)光細菌傳感器系統(tǒng)結構概述

本設計將發(fā)光細菌固定成便于攜帶、安裝與保存的生物膜組件，使其與經過預處理的外來毒物在反應室內反應15 min，產生光信號變化；微弱的發(fā)光細菌光信號通過多模光纖傳輸至高靈敏度的光電轉換器，本研究采用光電倍增管R105(北京濱松電子)實現光信號與電信號的轉換；然后通過高精度放大器件OP124制成放大電路將微弱電信號放大到0～5 V，OP124運算放大器屬于高精度、低溫漂、電流噪聲低類型的放大器，是電流電壓轉換核心器件；本設計采用了巴特沃斯低通濾波器，截止頻率為30 kHz,以消除外界信號的干擾.最后通過數據采集卡對信號進行采集、處理以及進行受試物的毒性評估[7].如圖1所示.

圖1 發(fā)光細菌傳感器系統(tǒng)組成

本設計以明亮發(fā)光桿菌為指示生物，其發(fā)射光為藍綠色熒光,光譜范圍420～670 nm ，波峰位置λmax在475～485 nm 左右.首先，將明亮發(fā)光桿菌固定成直徑為2 cm的生物膜組件，將其放入暗盒中，生物膜組件與光纖之間的距離為2 mm，在閉光的情況下通過檢測系統(tǒng)測定發(fā)光強度的變化值.采用劑量-效應實驗方法對毒性進行評估,發(fā)光細菌組件與受試物反應15 min后，發(fā)光量減弱到50%時的受試物濃度(50%)，即為EC50值.實際檢測通過相對發(fā)光量來反映污染物的急性毒性：

RLU=Vp/Vu×100%

式中：RLU為相對發(fā)光度；Vp加受試物細菌發(fā)光強度；Vu對照發(fā)光強度.

2 實驗方法

2.1 儀器

R105光電倍增管(北京濱松電子有限公司)、WLQ蠕動泵、暗盒式流通池、光纖、WC109-05恒溫器、RS9901生物發(fā)光儀(上海容圣生物電子公司)、VC9807勝利數字萬用表.

2.2 菌種及培養(yǎng)基

明亮發(fā)光桿菌(Photobacteriumphosphorreum)購自南京土壤所.

ASW培養(yǎng)基(W/V):胰蛋白胨(0.5%),酵母浸出汁(0.5%),氯化鈉(3%),磷酸氫二鈉(0.5%),磷酸二氫鉀(0.1%),甘油(0.3%),瓊脂粉(1.5%),pH 7.0.

2.3 受試物

Pb(NO3)2、CdCl2·3H2O、K2Cr2O7、Hg(NO3)2、CuSO4·5H2O,所用試劑均為分析純.

2.4 生物膜組件的構建

首先將細菌進行斜面培養(yǎng)，從斜面接菌種于ASW培養(yǎng)液中, 20 ℃恒溫, 200 r/min搖床培養(yǎng)15 h, 使菌數達到108～109個/mL.首先采用尼龍材質網制成直徑為2 cm的生物膜組件骨架，然后采用海藻酸鈉包埋法制備生物膜組件[8]，將30 g/L的海藻酸鈉溶液與等體積的108個/ mL的菌液緩慢混合在一起，混合均勻后，用注射器吸取0.8 mL的混合物均勻注入到尼龍網上面，固定成直徑為2 cm的均勻圓片[9]；將圓片浸在0.3 mg/L的CaCl2溶液中約20 min，使其充分固定.此生物膜組件限一次使用，保存在4 ℃條件下，使用時采用新鮮培養(yǎng)基復蘇，復蘇時間為20 min.

圖2 反應室示意圖

2.5 發(fā)光細菌傳感器的組裝

構建生物傳感器反應室，如圖2所示.將制備好的生物膜組件插入傳感器預留孔中構成反應室，生物膜組件與蠕動泵、光纖、暗盒、計算機控制系統(tǒng)構成發(fā)光細菌傳感器.此系統(tǒng)設計首先采用固定化技術將明亮發(fā)光桿菌固定成生物膜圓片，并將生物膜圓片插入傳感器反應室預留孔中，通過光纖傳輸變化的微弱光信號，光纖距生物膜間距為3 mm.采用高靈敏度光電轉化器件光電倍增管和高精度運算放大器將電流信號轉化為電壓信號并放大.設計濾波電路，截止頻率為30 kHz，以減少外界信號對微弱信號的干擾.最后，通過計算機控制系統(tǒng)將電信號轉化為模擬信號并運算輸出.傳感器結構示意圖如圖3所示，用蠕動泵吸取受試物，生物組件與受試物接觸15 min后光電檢測器件即開始檢測.

圖3 發(fā)光細菌傳感器示意圖

3 結果與討論

3.1 檢測條件的選擇

3.1.1 pH與溫度

在20 ℃條件下，反應池分別通入pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的未加受試物的底液，測得的發(fā)光變化值見表1.

由表1可見，受試物的pH值對毒性測定影響較大，過酸或過堿都會影響細菌的發(fā)光，這主要是由于過酸或過堿影響了發(fā)光細菌的代謝過程，使發(fā)光細菌不能正常代謝，導致發(fā)光量下降甚至發(fā)光猝滅.pH值在7.0左右時發(fā)光細菌發(fā)光量較為穩(wěn)定，故設定測量最適pH值為7.0.

在pH值為7.0的條件下，分別通入溫度為10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃的3% NaCl溶液，測得的發(fā)光變化值見表2.

表1 不同pH底液時細菌的發(fā)光強度

表2 不同溫度底液時細菌發(fā)光強度

表3 不同反應時間細菌發(fā)光強度

由表2可見，受試物的溫度對毒性測定影響較大，溫度過高或過低都會影響細菌的發(fā)光，這主要是由于溫度過高或過低都會影響發(fā)光細菌反應酶的活性，使發(fā)光細菌不能正常代謝，導致發(fā)光量下降甚至發(fā)光猝滅.溫度值在20 ℃時發(fā)光細菌發(fā)光量較為穩(wěn)定，故設定測量最適溫度值為20 ℃.

3.1.2 檢測時間的確定

在上述確定條件下，以0.15 mg/L Hg(Ⅱ)為受試物，測定發(fā)光細菌發(fā)光強度隨時間的變化，結果見表3.

如表3所示，發(fā)光細菌發(fā)光量變化經歷了先下降后平穩(wěn)的過程，在15 min時降為初始值的一半，相對偏差為2%.在5 min后下降變得緩慢，為了兼顧檢測速度與靈敏度，并與標準檢測方法做比較[10]，我們將檢測時間定為15 min，相對偏差為2%.

3.1.3 底液流速的確定

在上述確定條件下，以0.15 mg/L Hg(Ⅱ)為受試物，測定發(fā)光細菌發(fā)光強度隨時間的變化，結果見表4.

表4 不同底液流速細菌的發(fā)光強度

由表4可見，底液流速過高或過低都不利于發(fā)光細菌毒性檢測，底液流速過低，發(fā)光細菌所感受到的毒性物量不足；流速過高，毒性物質對發(fā)光細菌的毒性過大，較難真實反應細菌發(fā)光量受毒性抑制的情況，故設定底液流速為3 mL/min.

3.2 重金屬污染物毒性測定

在上述確定實驗條件下對Hg2+、 Cd2+、 Cr6+、Pb2+、 Cu2+的急性毒性進行了研究，將受試物用3%的NaCl溶液配成5個濃度梯度，如表5所示，攪拌均勻.以3% NaCl溶液做空白對照,每個濃度梯度設3個平行.取培養(yǎng)15 h后的菌液制成發(fā)光細菌生物膜組件，并用蠕動泵將受試物通入進水通道，用生物毒性測試儀測定發(fā)光強度.用直線內插法求出相對發(fā)光量為50%時所對應的毒性物質濃度，即為該毒物對發(fā)光細菌半數發(fā)光抑制濃度(EC50)[11].每個濃度梯度設3個平行實驗，標準偏差低于10%.

表5 受試物測試濃度

表6 受試物線形方程及相關系數

利用SPSS13.0軟件進行數據處理.

以離子濃度計算Pb2+、Cr6+、Cd2+、Hg2+、Cu2+對發(fā)光細菌的EC50,結果分別為16.55 mg/L、4.6 mg/L、10.53 mg/L、0.15 mg/L、19.06 mg/L，對發(fā)光菌的急性毒性從大至小依次為Hg2+> Cd2+> Cr6+> Pb2+> Cu2+.實驗結果采用線形回歸分析方法[12]，結果如表6所示.

如表6所示，重金屬對發(fā)光細菌毒性的大小順序為Hg2+> Cr6+> Cd2+> Pb2+>Cu2+，毒性的大小順序與采用國標推薦的方法測得的結果有很好的一致性.經分析，有可能是發(fā)光細菌的熒光酶受到金屬離子的負作用后抑制了發(fā)光細菌的正常代謝作用，導致發(fā)光量下降[13].

表7 傳感器系統(tǒng)穩(wěn)定性的測定

3.3 傳感器系統(tǒng)穩(wěn)定性的測定

選擇檢測條件pH值為7.0、溫度為20 ℃、測定時間為15 min、底液流速為3 mL/min.以Hg2+、 Cd2+為受試物，受試濃度分別為0.15 mg/L、10.53 mg/L，測定其相對發(fā)光量.設5個平行試驗，分別編號1，2，3，4，5組.

如表7所示，Hg2+、 Cd2+在pH值為7.0、溫度為20 ℃、測定時間為15 min、底液流速為3 mL/min條件下，以濃度分別為0.15 mg/L、10.53 mg/L測定其發(fā)光量在0.5左右，標準偏差分別為4.41%、6.11%，具有較好穩(wěn)定性，說明以上測量數據具有較高的可信度.

4 結 論

(1)該儀器符合國家質量技術監(jiān)督局、國家環(huán)境保護總局頒布的《GB/T1544121995 水質急性毒性的測定:發(fā)光細菌法》的測試方法，適合多種有毒化合物廢水生物毒性的測定，可廣泛應用于水質急性毒性的研究.

(2)該儀器采用了便于攜帶、安裝和保存的生物膜組件，大大提高了現場檢測的效率，為研究在線水質急性毒性檢測系統(tǒng)奠定了基礎.

(3)該儀器設計檢測與分析系統(tǒng)分開，延長了儀器的使用壽命，文中較為具體的分析了其使用條件，能夠準確的檢測水質毒性.

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