嚴(yán) 海,張 宇,于洪泉*,齊 玲,金 宏,姜亞磊,胡曉勇

（1.北華大學(xué)第二臨床學(xué)院腦外科;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科,吉林長春 130021;3.吉林醫(yī)藥學(xué)院病理教研室）

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,并且對正常細(xì)胞沒有明顯的毒性作用,因此在美國已進入臨床Ⅱ期藥物開發(fā)階段[1]。膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率最高的腦腫瘤,除手術(shù)切除外,現(xiàn)有放、化療等方法對于患者生存期的延長意義不大。國外已有TRAIL可以誘導(dǎo)多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的報道[2],國內(nèi)未見同類報道。因此,我們提出對原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)TRAIL誘導(dǎo)凋亡作用進行研究,為TRAIL作為腫瘤治療新藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)[3]取新鮮人腦膠質(zhì)瘤組織（吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院提供,病理診斷為Ⅲ-Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤）。去除壞死、出血部分。冷PBS沖洗后將組織剪成小塊（1mm×1mm大小）,置于離心管中,加入0.25%胰酶,37℃振蕩孵育30-45 min,離心棄上清,培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,計數(shù)活細(xì)胞,加入 10%DMEM/F12（Gibco）培養(yǎng)液,以1×106/75 cm2密度接種,將培養(yǎng)瓶置入37℃、5%CO2孵箱、飽和濕度下進行培養(yǎng),隔日換液,1∶3傳代。

1.2 TRAIL對膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用[4]細(xì)胞融合至85%,0.25%胰酶消化,計數(shù)活細(xì)胞,以每孔8×103個細(xì)胞接種于 96孔板中,培養(yǎng)24 h,將細(xì)胞分為4組,加入TRAIL（100 ng/ml）,對照組使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基。作用24 h后,小心棄上清,PBS洗去培養(yǎng)基,每孔加入酸性磷酸酶底物檢測溶液（用對硝基苯新鮮配制）100μl,繼續(xù)培養(yǎng)90min,加入終止液,室溫下孵育5min。酶標(biāo)儀405 nm處測定各孔光吸收值。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長情況 膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)酶消化分離后培養(yǎng),細(xì)胞生長情況良好,鏡下觀察2 h細(xì)胞開始出現(xiàn)貼壁生長,12 h左右大部分細(xì)胞均已發(fā)生貼壁,僅有少量細(xì)胞發(fā)生死亡,細(xì)胞伸展,在細(xì)胞的兩極開始出現(xiàn)突起,胞體呈長橢圓形,也可見其他不同形態(tài)的細(xì)胞。

2.2 TRAIL誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡情況 取獲得的三株原代培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株,未加TRAIL的對照組結(jié)果分別為0.23±0.02,0.51±0.02,0.36±0.01;經(jīng)TRAIL作用后,測定結(jié)果分別為0.24±0.01,0.12±0.01,0.22±0.01。在三株原代培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,GC321和GC125對兩株細(xì)胞對TRAIL的敏感性較高,結(jié)果有顯著性差異（P＜0.01）,而GC417則表現(xiàn)為稍有增殖（見表1）。

表1 TRAIL作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡情況（±s±s）GC417 GC321 GC125對照組 0.23±0.02 0.51±0.02 0.36±0.01 TRAIL組 0.24±0.01 0.12±0.01* 0.22±0.01*與對照組相比:*P＜0.01

3 討論

膠質(zhì)瘤是起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的最常見腫瘤,其發(fā)病率并不高,但由于其隱匿性,一經(jīng)發(fā)現(xiàn)病理診斷就是Ⅲ-Ⅳ膠質(zhì)瘤,其死亡率極高。并且由于在腦內(nèi)呈彌散分布[5],手術(shù)難以清除,即使清除,也由于散布有腫瘤細(xì)胞,使膠質(zhì)瘤易復(fù)發(fā)。TRAIL研究過程中遇到過很多問題,但它作為體內(nèi)免疫系統(tǒng)可以正常表達的產(chǎn)物[6],一直倍受關(guān)注。

人們想通過一種天然物質(zhì)或天然抗腫瘤機制的研究,找到一種理想的腫瘤治療新藥。TRAIL研究中發(fā)現(xiàn),它可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[7],但同時在多種腫瘤來源的細(xì)胞株中也廣泛存在著藥物耐受和抵抗現(xiàn)象[8],并且到目前為止,科研人員還在對抵抗或耐受的機制研究做著不懈的努力。由于大部分的研究都是針對已獲得的腫瘤細(xì)胞株,但對于從病人獲得的原代培養(yǎng)的細(xì)胞株,國內(nèi)研究還較少,因此,我們從臨床上獲得腦膠質(zhì)瘤組織,分離出膠質(zhì)瘤細(xì)胞,對TRAIL進行研究。

結(jié)果發(fā)現(xiàn),雖然同為原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞,但三株細(xì)胞TRAIL的反應(yīng)也不相同,有一定差異。其中,GC417對TRAIL完全不敏感,甚至在100 ng/m l TRAIL作用后,細(xì)胞仍出現(xiàn)輕微的增殖反應(yīng)。而GC321則對TRAIL非常敏感,在100ng/ml TRAIL作用后,出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡反應(yīng)。而GC125介于兩者之間。這說明,不同來源的膠質(zhì)瘤細(xì)胞對TRAIL的反應(yīng)性不同,但是什么原因?qū)е铝思?xì)胞對TRAIL的反應(yīng)不同,還需要進一步研究,并明確在細(xì)胞中,決定藥物敏感性的因素。

[1]Anita C,Ling Qi,Patrick Mulligan,etal.TRA ILAgonistsonClinical Trials for Cancer Therapy:The Promises and the Challenges[J].Reviewson RecentClinical Trials（Online）.2009,（4）:34.

[2]Song JH,Bellail A,TseMC,etal.Human Astrocytes Are Resistant to Fas Ligand and Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand-Induced Apoptosis[J].Neuroscience.2006,26（12）:3299.

[3]齊 玲,金 宏,丁麗娟,等.腦腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究[J].中國實驗診斷學(xué).2011,15（2）:227.

[4]畢莉莉,齊 玲,李景輝,等.老年腦萎縮患者血清中TNF表達[J].中國實驗診斷學(xué).2011,15（2）:335.

[5]Holland EC,G lioblastomamultiforme:the term inator[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97（12）:6242.

[6]Smyth MJ,Takeda K,Hayakawa Y,et al.Nature's TRAIL-on a path to cancer immunotherapy[J].Immunity.2003,18（1）:1.

[7]Griffith TS,Anderson RD,Davidson BL,et al.Adenoviral-mediated transfer of the TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2 ligand gene induces tumor cell apoptosis[J].JImmunol.2000,165（5）:2886.

[8]Guo L,Fan L,Pang Z,et al.TRAIL and doxorubicin combination enhancesanti-glioblastoma effect based on passive tumor targeting of liposomes[J].JControl Release.2011.[Epub ahead of print].