游思湘,李麗立,劉湘新,張 彬

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,湖南 長沙 410128;2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,湖南長沙 410125;3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙 410128)

金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是一類廣泛存在于生物體中的低分子量、富含金屬和半胱氨酸且能被金屬或其他因素誘導(dǎo)生成的金屬結(jié)合蛋白。由于MT在微量元素儲存、運輸和代謝,重金屬解毒;拮抗電離輻射;清除自由基以及機體生長、發(fā)育、生殖、衰老、腫瘤發(fā)生、免疫、應(yīng)激反應(yīng)等方面均具有重要的生物學(xué)作用[1-3],因此許多科研工作者對MT進行了廣泛而深入的研究。這些研究主要集中在MT的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)及其表達調(diào)控、生物學(xué)功能、與疾病的關(guān)系等方面[4-5]。但MT在應(yīng)激狀況下對機體哪些生理生化指標發(fā)生影響?這些影響對應(yīng)激具有何作用?目前很少報道。本文探討不同劑量MT對應(yīng)激豬血清和肌肉中非酯化脂肪酸及肌乳酸的影響,初步了解MT在動物應(yīng)激反應(yīng)過程中的作用,以期為MT在畜牧業(yè)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 15日齡健康杜長大雜交乳豬18頭,平均體重為4.8 kg。

1.2 儀器設(shè)備 AY-220電子天平(日本島津制作所),UV-9100紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器有限公司)、離心機(上海滬西分析儀器廠),恒溫水箱(長沙市清水塘醫(yī)療器械廠DHS-500)。

1.3 試劑 試驗用MT為本實驗室制備、分離、純化[6]和定量[7]。其余試劑均為AR級。

1.4 分組及處理 將18頭供試豬隨機分為A、B、C 3組,每組6頭。A組為對照組,不給MT;B組(低劑量試驗組)和C組(高劑量試驗組)分別肌肉注射MT 0.8 mg/kg體重劑量和1.6 mg/kg體重劑量;肌肉注射后驅(qū)趕運動25 min使乳豬產(chǎn)生應(yīng)激。應(yīng)激體征為:心跳 120次/min以上,呼吸 45次/min以上。

1.5 血樣的采集 分別在肌肉注射MT 3 h和6 h后,每組隨機抽取3頭豬,采血,3 000 r/min離心20 min,分離血清,低溫冷藏備用。

1.6 組織樣品的采集 分別在肌肉注射MT 3 h和6 h后,每組隨機抽取3頭豬,屠宰取背最長肌5 g,供測定非酯化脂肪酸和乳酸。

1.7 組織樣品處理 非酯化脂肪酸提取:取背最長肌2 g,用剪刀剪碎→研磨成肉糜→用氯仿萃取。

乳酸提取:取背最長肌2 g,用剪刀剪碎→加生理鹽水研磨成肉糜→攪動20min,3 000 r/m in離心10 min,取上清,采用鎢酸法沉淀蛋白質(zhì)。

1.8 測定方法 非酯化脂肪酸測定采用一次提取比色法,乳酸測定采用分光光度計測定法。

1.9 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示,應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 驅(qū)趕應(yīng)激3 h后,豬血清和肌肉中非酯化脂肪酸含量的變化 肌肉注射不同劑量金屬硫蛋白并驅(qū)趕應(yīng)激3 h后,豬血清和肌肉中非酯化脂肪酸含量的變化見表1。A組血清中非酯化脂肪酸的含量為118.51±8.52μmol/100 m L;B組和C組分別為159.14±5.17μmol/100 m L和 111.45±4.71 μmol/100m L,與A組相比,B組非酯化脂肪酸的含量明顯增加,兩者差異極顯著(P＜0.01)。C組非酯化脂肪酸的含量與A組基本相同。A組肌肉中非酯化脂肪酸的含量為322.87±19.4μmol/100 g,B組和C組分別為405.30±17.71μm ol/100 g和396.54±15.14μmol/100 g,B、C兩組與 A組比較差異極顯著(P＜0.01)。

表1 肌肉注射不同劑量金屬硫蛋白并驅(qū)趕應(yīng)激3 h后豬血清和肌肉中的非酯化脂肪酸含量

2.2 驅(qū)趕應(yīng)激6 h后,豬血清和肌肉中非酯化脂肪酸含量的變化 肌肉注射不同劑量金屬硫蛋白并驅(qū)趕應(yīng)激6 h后,豬血清和肌肉中非酯化脂肪酸含量的變化見表2。A組血清中非酯化脂肪酸的含量為178.71±16.45μmol/100 m L;B組和C組分別為94.43±14.11μmol/100 m L和 225.73±22.83μmol/100 m L,與A組相比,B組非酯化脂肪酸的含量明顯降低,兩者差異極顯著(P＜0.01)。C組非酯化脂肪酸的含量與A組比較明顯增加(P＜0.01)。A組肌肉中非酯化脂肪酸的含量為385.33±1.18μmo l/100 g;B組和C組分別為386.83±1.84μmol/100 g和 395.98±8.85μmol/100 g,B和C組非酯化脂肪酸的含量與A比較,基本上無差異。

表2 肌肉注射不同劑量金屬硫蛋白并驅(qū)趕應(yīng)激6 h后豬血清和肌肉中的非酯化脂肪酸含量

2.3 驅(qū)趕應(yīng)激后,豬肌肉中乳酸含量的變化 肌肉注射不同劑量金屬硫蛋白并驅(qū)趕應(yīng)激3 h和6 h后,豬肌肉中乳酸含量的變化見表3。驅(qū)趕應(yīng)激3 h后,A組肌肉中乳酸的含量為172.53±9.30 mg/100 g,B組為 163.07±2.72mg/100 g,C組為123.04±11.50m g/100 g,與A組比較,C組乳酸含量明顯降低,兩者差異極顯著(P＜0.01);B組乳酸含量與A組無差異(P＞0.05)。驅(qū)趕應(yīng)激6 h后,A組肌肉中乳酸的含量為193.39±5.19 mg/100 g,B組為 105.38±6.78mg/100 g,C組為139.47±14.17 mg/100 g,B組乳酸含量明顯降低,C組變化不大,但總的說來,各試驗組均低于對照組,而且差異極顯著(P＜0.01)。

表3 肌肉注射不同劑量金屬硫蛋白并驅(qū)趕應(yīng)激3 h和6 h后豬肌肉中乳酸含量

3 分析與討論

3.1 注射不同劑量MT對應(yīng)激豬血清中非酯化脂肪酸(NEFA)的影響 已知血漿中非酯化脂肪酸的主要來源是脂肪的動員。因此,一般用血漿中脂肪酸的含量來衡量脂肪動員的程度[8]。在應(yīng)激、饑餓或長時間運動等生理條件下,即當機體的能量消耗增強或糖的攝入不足時,脂肪組織中脂肪的動員就會加強,各組織首先是肌肉對它的利用加快。當組織攝入非酯化脂肪酸的速度加快時就會自動促進細胞對它的氧化。本試驗結(jié)果表明,低劑量金屬硫蛋白在應(yīng)激初期,能夠升高血清中的非酯化脂肪酸含量。隨著應(yīng)激時間的延長,高劑量試驗組表現(xiàn)出顯著升高血清中的非酯化脂肪酸含量的作用。據(jù)報道[9-10]:高FFA(游離脂肪酸或非酯化脂肪酸)可使胞質(zhì)內(nèi)長鏈脂肪酸輔酶A(1ihocholicacid.coenzymeA,LCA-CoA)水平升高,升高的LCA-CoA使丙二酰CoA對肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ(carnitinepalmitoy ltransferase-1,CPT-1)的抑制作用減弱,肝內(nèi)FFA的氧化作用增強,糖異生酶活性升高,引起肝糖異生和肝糖原輸出增加。在應(yīng)激情況下,MT能夠顯著升高非酯化脂肪酸含量,增加非酯化脂肪酸的氧化,減少葡萄糖的消耗,進而引起肝臟糖異生作用增強及肝糖原分解加快,以滿足應(yīng)激狀態(tài)下整個機體對能量的需要,因此,具有應(yīng)激保護作用。

3.2 注射不同劑量MT對應(yīng)激豬肌肉中非酯化脂肪酸含量的影響 已知非酯化脂肪酸可通過促進或抑制相應(yīng)酶的基因表達來影響糖的代謝過程,如蘋果酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸激酶以及干擾胰島素的分泌。升高的非酯化脂肪酸使線粒體中的NADH/NAD+的比例升高,導(dǎo)致丙酮酸脫氫酶的活性下降或失活,進而使檸檬酸濃度升高,抑制糖分解過程中的關(guān)鍵酶-磷酸果糖激酶,使6-磷酸葡萄糖堆積,較高濃度的6-磷酸葡萄糖將抑制己糖激酶I,最終導(dǎo)致肌肉組織對糖的攝取與分解速度降低,以保證大腦、神經(jīng)組織和紅細胞等對葡萄糖有特殊需要的組織維持正常機能,有效地起到應(yīng)激保護作用[11]。但隨著運動時間的延長,血漿中非酯化脂肪酸含量雖然還是增加(高劑量組),但肌肉組織中非酯化脂肪酸含量則基本不變,說明此時肝臟加速了對非酯化脂肪酸的加工,大量非酯化脂肪酸在肝臟轉(zhuǎn)變?yōu)橥w,使體內(nèi)能量代謝發(fā)生改變,運動后期肌肉組織通過攝入大量酮體來補充能量的需要。酮體是運動晚期的重要能源物質(zhì)[12]。

3.3 注射不同劑量MT對應(yīng)激豬肌肉中乳酸含量的影響 糖的分解供能過程中,無論是有氧氧化還是糖酵解過程,都要經(jīng)過將葡萄糖轉(zhuǎn)變成丙酮酸的系列反應(yīng),然后,沿著不同的途徑進行代謝。故隨著運動強度的增大,需能量增加,肌肉中丙酮酸含量顯著升高。如果丙酮酸的生成速率超過線粒體的代謝能力,大量的丙酮酸必然由乳酸脫氫酶催化轉(zhuǎn)化成為乳酸[13]。但近年研究發(fā)現(xiàn)運動過程中,線粒體并不缺氧,同時,大量的研究發(fā)現(xiàn),通過服用二氯乙酸鹽。提高丙酮酸脫氫酶的活性可明顯降低乳酸的生成,故認為在正常大氣中進行大強度運動時肌肉中乳酸的生成,可能是由于丙酮酸的生成量大于線粒體的氧化磷酸化能力,使過多的丙酮酸在乳酸脫氫酶作用下生成乳酸,而不能簡單認為是由于機體的缺氧造成的[13-14]。NADH升高引起細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變,可刺激乳酸生成;NADH/NAD比值升高有利于丙酮酸脫氫酶從有活性狀態(tài)向無活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變,從而降低了氧化磷酸化作用[14]。

試驗結(jié)果表明:在驅(qū)趕應(yīng)激6 h后,試驗組和對照組雖然都是完成相同運動負荷,但試驗組肌肉中乳酸含量低得多,說明MT具有增強線粒體的氧化磷酸化作用,提高機體的有氧代謝和運動耐力,因此能夠緩解疲勞程度,提高應(yīng)激能力。

[1] 鄭軍恒,李海洋,茹剛,等.金屬硫蛋白清除自由基功能的研究[J].北京大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,1999,35(2):573-576.

[2] Min K S.Physiological significance of metallothionein in oxidative stress[J].Yakugaku Zasshi,2007,127(4):695-702.

[3] Karin S K,Ross H C,H ans O P,eta l.Animal performance and stress:responses and toleran ce lim its at differen t levels of biological organization[J].Biological Review s,2009,84:277-292.

[4] Li L L,Yin Y L,Zhang B,et al.Intramuscular adm inistration of Zincm etallothionein to p reslaugh ter stressed pigs improves anti-oxidative status and pork quality[J].Asian-Aust J Anim Sci,2007,20(5):761-767.

[5] 肖定福,張彬,李忠義,等.不同應(yīng)激因子對小白鼠肝臟金屬硫蛋白誘導(dǎo)合成的影響[J].中國實驗動物學(xué)報,2009,17(2):90-96.

[6] 李麗立.一種豬肝金屬硫蛋白的提取方法[P].中國發(fā)明專利:ZL200410013212.X,2006-4-17.

[7] 張彬,吳力專,李麗立.一種豬金屬硫蛋白的檢測方法[P].中國發(fā)明專利:ZL 200410061265.9,2007-5-9.

[8] Christina K,Michael D.Free fatty acidm etabolism in human obesity[J].JLipid Res,2006,47:1643-1650.

[9] Edgar A,Ping H,Run X,et al.Hum an glomerular endothelium:interplay am ong glucose,free fatty acids,angiotensin II,and oxidative stress[J].Am J Physiol Renal Physiol,2010,298:125-132.

[10]盧雁,韓萍,趙晟.游離脂肪酸對肝臟氧化應(yīng)激及胰島素抵抗的影響[J].世界華人消化雜志,2009,17(23):2405-2408.

[11]Lavoie F,Frisch F,Brassard P,et al.Relationship between Total and High Molecular Weight Adiponectin Levels and Plasma Nonesterified Fatty Acid Tolerance du ring Enhanced Intravascu lar Triacylglycerol Lipoly sis in Men[J].JC lin Endocrinol Metab,2009,94:998-1004.

[12]A lison B,Yang Q,Holly A,et a l.Chylom icron Rem nan ts and Nonesterified Fatty Acids Differ in Their Ability to Inhibit Genes Involved in Lipogenesis in Rats[J].JNutr,2011,141(5):171-176.

[13]馬延超 ,高松山,張振峰.運動過程中肌乳酸產(chǎn)生機制的探討[J].沈陽體育學(xué)院學(xué)報,2004,23(3):312-314.

[14]洪平,趙鵬,楊奎生.不同強度運動時大鼠骨骼肌能量代謝產(chǎn)物的變化[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志,2002,21(3):263-267.