劉紀(jì)成,吳海港,易先國,張廣強,李 衛(wèi),李 洵,劉錦妮

(1.信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校,河南信陽 464000;2.西安天星生物藥業(yè)股份有限公司,陜西西安 710075)

雞大腸桿菌病是由致病性血清型的大腸桿菌引起的多種疾病的總稱。在臨床上可表現(xiàn)為臍炎、敗血癥、肉芽腫、全眼球炎、氣囊炎、腹膜炎、輸卵管炎等;還常常與病毒和其他細(xì)菌性疾病并發(fā),造成雞群的高死亡率,給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失。為了解豫南地區(qū)雞肺臟中大腸桿菌的血清型及藥敏性,以便有效地開展預(yù)防和治療工作,我們進行了雞肺臟大腸桿菌的分離、血清型鑒定及藥敏試驗,結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料 于2009年1～9月間,從豫南地區(qū)正陽、平輿、固始、淮濱等10個縣的42家肉種雞場、肉仔雞飼養(yǎng)場、蛋種雞場、蛋雞場采取。

1.2 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)血清 由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.3 供試動物 試驗用小鼠由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院提供,體重15～25 g,雛雞購于湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)院SPF雞場。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株 購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.5 藥敏試紙 購于杭州藥物研究所。

1.6 病原菌的分離鑒定 無菌采取具有敗血癥、心包炎、肝周炎等病理變化的病死雞心血、肝臟、脾臟,分別接種于普通肉湯、普通瓊脂、血液瓊脂和麥康凱瓊脂,伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24 h,挑選麥康凱瓊脂平板上磚紅色菌落接種普通瓊脂斜面進行純培養(yǎng),培養(yǎng)后膠塞密封,置4℃冰箱保存?zhèn)溆?同時另挑選單個菌落涂片革蘭染色,進行菌體形態(tài)和染色特征的觀查。

1.7 生化鑒定 取M.C瓊脂平板上粉紅色單菌落接種于普通肉湯,于37℃培養(yǎng)18 h,按常規(guī)方法進行糖類發(fā)酵試驗及生化反應(yīng)[1]。

1.8 致死性試驗 取體重15～25 g健康小鼠100只和10日齡雛雞100只,分別隨機分組,每組 4只,試驗組小鼠腹腔接種24 h肉湯培養(yǎng)物0.2m L/只 ,試驗組雛雞肌肉注射24 h肉湯培養(yǎng)物0.4 m L/只,對照組分別用同樣方法接種滅菌生理鹽水。觀察發(fā)病和死亡情況、剖檢變化,并進行細(xì)菌分離。

1.9 血清型鑒定 經(jīng)分離培養(yǎng)、形態(tài)特點和生化試驗鑒定為大腸桿菌后,再用普通瓊脂進行純培養(yǎng)(37℃、18 h),然后用少量(5 m L/L)石炭酸生理鹽水將菌苔洗下,制成濃稠菌懸液,經(jīng)過121℃高壓2 h,破壞其K抗原,冷卻后取一鉑金耳與血清(5～10倍稀釋)在玻板上混勻,如0.5m in內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng),同時以菌懸液與生理鹽水混合物作對照,觀察有無自凝集現(xiàn)象[2]。

1.10 藥敏試驗 方法按藥敏紙片說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離 在普通瓊脂平板上長出表面光滑、濕潤、半透明、灰白色、圓形微凸起、中等大的菌落,在血液瓊脂平板上長出菌落較大、邊緣整齊、并有隆起的灰白色菌落,多數(shù)不溶血。在麥康凱瓊脂平板上,形成中等大小的磚紅色菌落,在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上,形成帶有金屬光澤的紫黑色小菌落。在肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h后,呈均勻混濁,管底有淡白色黏稠沉淀,管壁液面有菌環(huán)。

2.2 染色鏡檢 病料及培養(yǎng)物涂片染色鏡檢均可見兩端純圓、多數(shù)散在排列、革蘭陰性短桿菌。

2.3 生化鑒定結(jié)果 34株致病性大腸桿菌的生化試驗結(jié)果見表1,從表1可以看出各株均能在三糖鐵培養(yǎng)基上產(chǎn)酸產(chǎn)氣使培養(yǎng)基變黃,均不產(chǎn)生H 2 S。在發(fā)酵葡萄糖、V-P試驗、M.R.試驗、吲哚試驗、檸檬酸鹽利用試驗等常規(guī)生化試驗結(jié)果完全符合大腸桿菌的生化特征,但在某些糖、醇的常規(guī)生化試驗結(jié)果出現(xiàn)了一些差異。

2.4 致死試驗結(jié)果 試驗動物接種后連續(xù)觀察8 d,小鼠試驗結(jié)果是25株能全部致死小鼠,4株部分致死,5株不能致死。剖檢死亡鼠,心外膜出血,肝腫脹、發(fā)黑或出血,雛雞試驗結(jié)果23株能全部致死雛雞,5株部分致死,6株不能致死雛雞,剖檢死亡雛雞,表現(xiàn)為纖維素性心包炎、心包積液,肝周炎、肝表面被一層薄膜狀纖維素性滲出物覆蓋,氣囊炎。從死亡小鼠和雛雞肝臟、腹水、脾臟回收菌的形態(tài)染色,生化特性與接種菌一致。

2.5 血清鑒定結(jié)果 從10個縣市共分離34株大腸桿菌,除2株未能定性外,共出現(xiàn)10種血清型,結(jié)果見表2,從表2可以看出,雞肺臟中分離的大腸桿菌以 O2、O78、O26、O22、O1為主,這 5 種血清型合計菌株26株,占定性菌株的81.25%。

表1 各菌株的生化鑒定結(jié)果

表2 32株致病性大腸桿菌的血清型

2.6 藥敏試驗 分離的大腸桿菌對強力霉素、氟苯尼考、丁胺卡那霉素、培氟沙星高度敏感;對氧氟沙星、恩諾沙星、新霉素、氨芐青霉素中度敏感;對環(huán)丙沙星、利福平、氟哌酸、鏈霉素、紅霉素、土霉素不敏感。結(jié)果見表3、表4。

表3 34株大腸桿菌對14種抗生素的判斷標(biāo)準(zhǔn) (%)

表4 34株大腸桿菌對14種抗生素的敏感結(jié)果

3 討論

3.1 血清型鑒定結(jié)果表明,34株雞致病性大腸桿菌的血清型比較復(fù)雜,不同來源的大腸桿菌血清型差異較大,同一來源的菌株O血清型也多不相同。對豫南地區(qū)10個縣市42個雞場中病雞肺臟中分離的大腸桿菌血清型以 O2、O78、O26、O22 、O1 為主 ,這與文獻(xiàn)報道有相同,也有差異,這可能與取樣量較少或取樣不具有代表性或血清型鑒定具有時間、環(huán)境特異性有關(guān)

3.2 采用參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)所推薦的紙片擴散方法(即Kirby-Bauer的菌液涂布法)進行。對從豫南地區(qū)分離出的34株致病性大腸桿菌所做的14種抗生素藥敏試驗,結(jié)果表明:大腸桿菌的特點是易形成耐藥性,此次分離的大腸桿菌對強力霉素、氟苯尼考、丁胺卡那霉素、培氟沙星高度敏感;而對環(huán)丙沙星、利福平、氟哌酸、鏈霉素、紅霉素、土霉素不敏感。結(jié)果還顯示,分離到多數(shù)致病性菌株表現(xiàn)多種耐藥性,在以上所分離的菌株中以三耐、四耐、五耐為主,分別有5、10株和 14株,耐藥率分別為14.71%、29.41%和 38.24%,共占總分離菌株的82.36%。這些結(jié)果與劉吉山等[3]報道的安徽地區(qū)雞致病性大腸桿菌耐藥性以及李文剛等[4]報道河南省致病性大腸桿菌的多重耐藥性基本一致。而本試驗分離的大腸桿菌對環(huán)丙沙星、利福平、氟哌酸的耐藥性較高,可以看出近幾年大腸桿菌對氟喹諾酮的耐藥性增高趨勢明顯。這種耐藥性的出現(xiàn)可能與菌株長期處于環(huán)境中抗生素的選擇性壓力,及耐藥基因通過染色體或耐藥質(zhì)粒在菌群間的廣泛傳播或擴散有關(guān)[5]。最近幾年家禽養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展,對疾病的預(yù)防和控制顯得非常重要,尤其是在人們?nèi)狈︷B(yǎng)殖業(yè)方面的知識,在飼料添加劑及治療中常盲目使用抗菌藥物,導(dǎo)致產(chǎn)生許多耐藥性菌株。大腸桿菌的血清型繁多這也是產(chǎn)生耐藥性的原因之一[6],在選擇抗菌藥物上建議考慮采取聯(lián)合用藥、交叉用藥、輪換用藥的方式,一方面可以充分發(fā)揮抗菌藥物之間的協(xié)同作用,增加療效;另一方面可以避免細(xì)菌長期與某一種藥物接觸,減少產(chǎn)生耐藥性幾率。由于大腸桿菌的血清型分布地區(qū)差異比較大、臨床用藥的差異等因素,使得各地區(qū)、各養(yǎng)殖場大腸桿菌的耐藥譜差異很大[7]。因此,定期對分離菌株進行抗生素敏感性的監(jiān)測,對有效防治養(yǎng)雞場細(xì)菌性疾病有著重要的意義。

[1] 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱病毒研究所.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1998:98-101.

[2] 夏業(yè)才,潘松年.禽大腸桿菌的研究一致病性大腸桿菌血清型鑒定[J].中國獸藥雜志,1991,25(4):1-2.

[3] 劉吉山,沈志強,李峰.雞大腸桿菌病病原鑒定及藥敏試驗[J].養(yǎng)禽與禽病防治,2000(2):190.

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