張亞玉，宋曉霞，孫 海，汪景寬，于 樹*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 吉林 132109；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤與環(huán)境學(xué)院，沈陽 110161）

野山參（Wild ginseng）為五加科人參屬多年生草本植物，其根為道地中草藥，吉林省東部山區(qū)被認(rèn)為是人參最適宜的生長區(qū)，而撫松縣被譽(yù)為“人參之鄉(xiāng)”，自古就是人參的主產(chǎn)區(qū)，出產(chǎn)優(yōu)質(zhì)野山參。野山參是指自然生長在原始森林中，沒有人為因素影響的一類人參。野山參的藥用價(jià)值極高，早在2000年前，《神農(nóng)本草經(jīng)》中對野山參的藥用價(jià)值就有了詳細(xì)的記載，《本草綱目》中稱野山參為“神草”，列為藥中上品，具有生津安神、補(bǔ)虛固脫、大補(bǔ)元?dú)?、?qiáng)精健身益壽延年之功效[1]。但隨著對野山參無度采挖，導(dǎo)致目前野山參資源瀕于滅絕的地步。而林下參和農(nóng)田栽參的發(fā)展既是對山參資源的保護(hù)，又可滿足人們對人參產(chǎn)品的需求，也為參農(nóng)提供了治富之路，為農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整提供了新的思路。但在林下參發(fā)展過程中由于選地不當(dāng)，林下參的存苗率低，形體變劣的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生；農(nóng)田栽參過程中由于改土不當(dāng)，存在產(chǎn)量低、病害重，且存在嚴(yán)重的連作障礙，限制了參業(yè)的發(fā)展，而上述問題的產(chǎn)生均與土壤的物理、化學(xué)及微生物特性等關(guān)系密切[2-4]。通過對栽參土壤和老參地土壤的微生物及酶活性的研究，多數(shù)專家提出土壤微生物群落的改變可能是人參連作障礙的根源。野山參在深山密林中生長十年、幾十年甚至上百年，其能夠安然無恙，與其特有的土壤微生物群落特性直接相關(guān)。前人對于人參土壤微生物的研究多采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，由于可培養(yǎng)的微生物種類僅占土壤微生物的1%左右，所以對于微生物的真實(shí)性存在一定的誤差，而磷脂脂肪酸PLFA方法是一種快速、重現(xiàn)性好的分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的方法，可以分析所有活體微生物（包括可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物）。而且，信息準(zhǔn)確度高，應(yīng)用范圍廣，操作簡便，可以同時(shí)處理大量的樣品，是對土壤中活體微生物的真實(shí)反映[5-8]。本文利用磷脂脂肪酸法通過對野山參根區(qū)土壤微生物結(jié)構(gòu)特性與非根區(qū)土壤微生物群落的對比分析，明確山參根區(qū)土壤的微生物結(jié)構(gòu)特征，期望能在農(nóng)田栽參土壤改良和林下參護(hù)育選地方面提供幫助，為人參產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土壤樣品采自吉林省人參之鄉(xiāng)的撫松縣露水河鎮(zhèn)楞場村，離村5 km的黑熊溝山上，1號（大約12年生）野山參土壤位于東經(jīng)127°44′、北緯42°47′、海拔（780±9）m，2號（大約25年生）野山參位于東經(jīng)127°57′、北緯42°33′、海拔（650±5）m，采集地土壤類型為暗棕壤，該區(qū)是野山參經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)的地域。

1.2 采樣方法

首先除去表面的枯枝落葉層后，邊抬參邊取土，由于野山參生長的特殊性，每年在生長期其須根周圍均長出許多營養(yǎng)吸收根，枯萎期時(shí)有的脫落，有的在須根上形成珍珠點(diǎn)，使野山參根圈土壤可以擴(kuò)展到須根周圍2 cm左右的范圍，對照為非根區(qū)土壤，在附近采集，采集深度與參層土壤樣品相對應(yīng)。取回的新鮮土樣放入4℃的冰箱貯存待測。野山參根區(qū)土壤的基本性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤基本性質(zhì)Table1 Some basic properties of tested soil

1.3 測試方法

土壤微生物磷脂脂肪酸的測定在White的方法[9]上加以改進(jìn)。①鮮土加入檸檬酸緩沖液∶氯仿∶甲醇=0.8∶1∶2，25℃避光震蕩，離心。再加入檸檬酸緩沖液∶氯仿∶甲醇=0.9∶1∶1，震蕩，避光保存，經(jīng)18 h分離后，用吸管把上層液吸走，保留底層氯仿相在氮?dú)饬飨麓蹈?。②用柱層析硅膠0.8 g（在120℃下烘干2 h）填充玻璃管柱（直徑6 mm），依次分別加10mL氯仿、10mL丙酮、10mL甲醇，收集到的磷脂脂肪酸在甲醇相中，在氮?dú)饬飨麓蹈蓸悠贰＂巯蚋蓸悠分屑尤?mL甲醇∶甲苯（1∶1）混合液和1mL 0.2 mol·L-1KOH甲醇溶液，37℃水浴15 min后，冷卻至室溫，依次加入2mL去離子水，0.3mL 1 mol·L-1HAc，2mL正己烷，震蕩，離心，甲酯化的C19:0為內(nèi)標(biāo)，氮?dú)饬飨麓蹈桑?20℃下保存。外標(biāo)為SupelcoTM37 Component FAME Mix和Bacterial Acid Methl Esters Mix。

檢測部分由安捷倫GC-MS（6890 N-5973 N）完成。色譜柱為hp5-MS（30 m×250 um×0.25 um）石英毛細(xì)管柱。GC-MS分析條件:升溫程序:進(jìn)樣后在70℃保持5 min，之后以20℃·min-1的速率升至190℃，保持1 min，以5℃·min-1的速率上升到200℃，停留2 min，以10℃·min-1的速率上升到280℃，保留8 min。進(jìn)樣口溫度為250℃，載氣為He（0.9mL·min-1），分流比為 10∶1，離子源溫度230℃，四極桿:150℃，質(zhì)譜全掃描范圍:30～600 m·z-1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel、SAS軟件進(jìn)行方差分析和PLFAs主成分分析。其中c、t、i和a分別表示順勢雙鍵、反勢雙鍵、順勢支鏈、反勢支鏈；br表示不確定支鏈位置，Me表示甲基位置，cy表示環(huán)丙基。結(jié)果見表2。

表2 磷脂脂肪酸的代表生物Table2 Biomarkers of some microbial groups in soil

2 結(jié)果與分析

本試驗(yàn)共測得1號土壤中的脂肪酸23種，2號土壤中脂肪酸19種，根區(qū)土壤與非根區(qū)土壤微生物所含脂肪酸種類基本相同。

2.1 野山參根區(qū)土壤的微生物PLFA圖譜的特征

結(jié)果見圖1、2。本研究鑒定的PLFAs，C鏈長度為14～24，包括飽和、不飽和、甲基化分支和環(huán)化脂肪譜，在野山參根區(qū)土壤的PLFAs中，i15:0，a15:0，i16:0，16:1w9c，16:1w9t，16:0，br17:0，i17:0，cy17:0，18:2w9，18:1w9c，18:1w9t等13種PLFAs在1號野山參土壤微生物豐度占97.28%，2號野山參中占84.89%，是山參根區(qū)土壤生態(tài)系統(tǒng)的主要生物成分。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，野山參根區(qū)土壤微生物總量與非根區(qū)土壤微生物總量相比，均有下降的趨勢。，野山參根區(qū)土壤的微生物組成也有所改變，對比所獲得的野山參樣品，1號野山參生長健康，無發(fā)病癥狀，研究1號根區(qū)土壤的微生物組成發(fā)現(xiàn)，根區(qū)中代表致病因素的真菌18:2w9，18:1w9c，18:1w9t的數(shù)量與對照相比明顯減少，而代表放線菌種類的10Me17:0卻明顯增加；由于在人參生產(chǎn)中，真菌病害的發(fā)生較為常見，2號野山參雖然年限較長，但身體已經(jīng)發(fā)生銹變的癥狀，可能與其根區(qū)土壤的微生物變化有著直接的關(guān)系，與對照相比，微生物的量雖然有減少的趨勢，但代表真菌18:1w9c，18:1w9t減少的程度并不顯著，有益微生物沒有增加均在減少，這與農(nóng)田土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)的變化與病害的發(fā)生直接相關(guān)相一致。

2.2 野山參根區(qū)土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)

通過PLFAs主成分分析可明顯的區(qū)分野山參根區(qū)土壤與對照土壤（見圖3），根區(qū)土壤在坐標(biāo)軸附近，而對照土壤則遠(yuǎn)離坐標(biāo)軸，說明野山參根區(qū)土壤微生物脂肪酸的組成和主成分一、二間的相關(guān)性不大或成負(fù)相關(guān)[12-13]。3個(gè)主成分得分解釋了81.03%和85.44%的變異。主成分一（PC1）解釋了36.54%和39.09%的變異，主成分二（PC2）解釋了28.65%和29.91%的變異，主成分三（PC3）解釋了15.83%和16.43%的變異，在測試的野山參根區(qū)土壤樣品中，PC1得分均比對照低。主成分一、二的因子分析表明i15:0，a15:0，16:1w9c，i17:0與主成分一呈高度正相關(guān)，而16:1w9t，16:0，br17:0，17:0（10Me），cy17:0，18:0（10Me）18:2w9，18:1w9c，18:1w9t與主成分成高度負(fù)相關(guān)，也就是與根區(qū)土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)直接相關(guān)。從對兩份土樣的分析看，野山參生長根區(qū)土壤微生物群落組成發(fā)生了改變，盡管兩份樣品采自不同的山上，但根區(qū)土壤的微生物群落的變化卻有相似的發(fā)展趨勢。

圖1 1號野山參PLFAs圖譜Fig.1 PLFAs profile of tested No.1 soil

圖2 2號野山參PLFAs圖譜Fig.2 PLFAs profile of tested No.2 soil

圖3 PLFAs主成分分析圖譜Fig.3 Principle components analysis of PLFA profiles from microbe

3 討 論

PLFAs在研究比較復(fù)雜環(huán)境中微生物群落組成方面應(yīng)用廣泛[14]，PLFAs的變化可以很好地反映野山參根區(qū)土壤微生物的變化，研究證明野山參根區(qū)土壤微生物脂肪酸圖譜與對照相比發(fā)生明顯的改變，野山參根區(qū)土壤的微生物總量明顯減少，代表真菌生物的18∶2w9，18∶1w9c，18∶1w9t總量與對照相比有減少的趨勢，這一結(jié)果有別與以往的相應(yīng)研究。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能與野山參的生長有直接關(guān)系，野山參在一地生長10年、20年甚至幾十年，不感病，也不出現(xiàn)平地栽參的連作障礙，特有的根區(qū)土壤微生物群落特性可能是其健康生長的直接原因。

對于土壤微生物的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，土壤微生物可培養(yǎng)的總量不足全部微生物的1%。分離結(jié)果不能夠反映土壤微生物的真實(shí)情況，利用PLFA分析發(fā)法可以培養(yǎng)幾乎土壤中全部的活體微生物，能夠比較準(zhǔn)確的反映土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)特征[15]，對野山參根區(qū)土壤所測得的23種PLFAs代表了土壤的細(xì)菌、真菌和放線菌，是野山參根區(qū)土壤生態(tài)系統(tǒng)的主要成分。結(jié)合以往對于栽培人參土壤微生物真菌培養(yǎng)研究的結(jié)果，在方法上為解決制約農(nóng)田栽參和老參地的微生物改造方面提供了方法指導(dǎo)。由于野山參資源的瀕臨滅絕，其根區(qū)土壤的獲得也較為珍貴，通過了解野山參根區(qū)土壤微生物群落特征，可以為農(nóng)田栽參土壤改良提供科學(xué)指導(dǎo)。為人參產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展提供新的理論支持。

[1]何永明.人參本草史考證[J].中成藥,2001,23(5):384-386.

[2]賈書剛,王淑平,竇森.栽培人參對床土化學(xué)性質(zhì)的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1992,14(2):42-46.

[3]竇森,張晉京,江源,等.栽參對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1996,18(3):67-73.

[4]于得榮,趙壽經(jīng),曹秀英,等.農(nóng)田土壤與高產(chǎn)人參腐殖土壤的理化性狀對比研究[J].土壤學(xué)報(bào),1990,27(2):228-232.

[5]宋曉霞,張亞玉,孫海.人參與西洋參土壤脲酶活性對比研究[J].特產(chǎn)研究,2008(2):33-35.

[6]張亞玉,宋曉霞,孫海.栽培人參、西洋參不同年限土壤酸堿度和酶活性的變化研究[J].特產(chǎn)研究,2008(4):33-35.

[7]白震,何紅波,張威,等.磷脂脂肪酸技術(shù)及其在土壤微生物研究中的應(yīng)用[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2006,26(7):2387-2393.

[8]焦曉丹,吳鳳芝.土壤微生物多樣性研究方法的進(jìn)展[J].土壤通報(bào),2004,35(6):789-792.

[9]White D C,Stair J O,Ringelberg D B.Quantitative comparisons of in situ microbial biodiversity by signature biomarker analysis[J].Joumal of Industry Microbiology,1996,17:185-196.

[10]Zelles L.Identification of single cultured microorganisms based on their whole community fatty acid profiles using extraction proce-dure Chemosphere,1999,39:665-682.

[11]Hamel C,Vujanovic V,Jeannotte R,et al.Negative feedeback on a perennial crop:Fusarium crown and root of asparagus is related to changes in soil microbial com-munity structure.Plant and Soil,2005,268:75-87.

[12]Blume E,Bischoff M,Reichert J M,et al.Surface and subsurface microbial biomass,community structure and metabolic activity as a function of soil depth and season.Appl Soil Ecol,2002,20:171-181.

[13]Justin B B,Myrold D D,Sulzman E W.Root control on soil microbial community structure in forest[J].Oecologia,2006,148(4):650-659.

[14]祁建軍,姚槐應(yīng),李先恩,等.磷脂脂肪酸法分析地黃根際土壤微生物多樣性[J].土壤,2008,40(3):448-454.

[15]于樹,汪景寬,李雙異.應(yīng)用PLFA方法分析長期不同施肥處理對玉米地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2008,28(9):4222-4227.