龐啟亮，霍貴成

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

發(fā)酵酸奶由于具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和良好的保健功能，普遍被消費(fèi)者認(rèn)可，其產(chǎn)銷(xiāo)量迅猛增長(zhǎng)。但在產(chǎn)品貯存、運(yùn)輸、銷(xiāo)售、食用前這一過(guò)程中，乳酸菌仍能分解乳糖，產(chǎn)生乳酸，發(fā)生后酸化（Postacidification）。酸奶儲(chǔ)存時(shí)的后酸化作用使酸奶的風(fēng)味變化，pH降低，甚至達(dá)到消費(fèi)者難以接受的程度。防止酸奶后酸化的方法多種多樣，如:調(diào)節(jié)球桿看比例，增加球菌比例；添加Nisin，抑制保加利亞乳桿菌的代謝。然而在乳酸菌中，控制后酸化最好的方法是控制保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)和能量代謝[1]。ATPase是控制保加利亞乳桿菌能量代謝的一個(gè)關(guān)鍵酶[2]，H+-ATPase維持細(xì)胞內(nèi)pH穩(wěn)定的產(chǎn)生H+離子梯度，并驅(qū)動(dòng)細(xì)胞糖和氨基酸的運(yùn)輸[3]。Kanner等利用新霉素選擇不同ATPase活性的乳酸菌，原理在于新霉素進(jìn)入細(xì)胞，需要H+-ATPase的協(xié)助，但細(xì)胞內(nèi)的新霉素對(duì)細(xì)胞有抑制作用，低活性H+-ATPase運(yùn)輸新霉素的能力弱，對(duì)新霉素富集作用低，在篩選培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，而正常菌株H+-ATPase運(yùn)輸相對(duì)較多新霉素，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[4]。

本試驗(yàn)利用新霉素[5]篩選德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）H+-ATPase是原有親本活性的60%[6]，由于H+-ATPase是細(xì)胞代謝關(guān)鍵的酶，所以篩選菌株相對(duì)較弱后酸化能力的同時(shí)生長(zhǎng)性能降低，通過(guò)高密度發(fā)酵，篩選適宜培養(yǎng)基并提高篩選菌種生物量得率成為發(fā)酵劑開(kāi)發(fā)的另一重點(diǎn)。通過(guò)對(duì)篩選菌株后酸化活性檢測(cè)，并篩選出適宜增殖培養(yǎng)基，為保加利亞乳桿菌H+-ATPase酶缺陷型菌株延緩后酸化發(fā)酵劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）L15，KLDS 1.9201，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；德氏乳桿菌保加利亞亞種L15-4，KLDS 1.9201-4，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室利用新霉素篩選自KLDS 1.9201；德氏乳桿菌保加利亞亞種LW-1自市售酸奶中分離（對(duì)照）；嗜熱鏈球菌（Streptococcus.thermophilus）S18，KLDS 3.9210由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

脫脂乳配制:脫脂乳溶于蒸餾水12.6%W/V，90℃，10 min番茄汁[7]:市售，無(wú)病蟲(chóng)害及機(jī)械損傷。新鮮番茄→清洗→熱燙（90～95℃，3 min）→榨汁→調(diào)配→滅菌備用。

MRS液體及MRS固體培養(yǎng)基，分別用于菌種活化及活菌計(jì)數(shù)[8]。

1.2 儀器

梅特勒-托利多Delta 320 pH計(jì)、超低溫冰箱（-80℃）、GL-21M高速冷凍離心機(jī)、BCN1360型生物潔凈工作臺(tái)、SPX-150B生化培養(yǎng)箱、3.7 L瑞士比歐發(fā)酵罐。

1.3 方法

1.3.1 菌種和培養(yǎng)條件

德氏乳桿菌保加利亞亞種L15，德氏乳桿菌保加利亞亞種L15-4，德氏乳桿菌保加利亞亞種LW-1，MRS培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18 h，4℃低溫離心5000 r·min-1，10 min，生理鹽水洗滌兩次，滅菌脫脂乳懸浮，-80℃儲(chǔ)存。S18在M17培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18 h，4℃ 低溫離心5000 r·min-1，10 min，生理鹽水洗滌2次，滅菌脫脂乳懸浮，-80℃儲(chǔ)存。

1.3.2 發(fā)酵酸奶

德氏乳桿菌保加利亞亞種L15，德氏乳桿菌保加利亞亞種L15-4，德氏乳桿菌保加利亞亞種LW-1分別接種5.0×106cfu·mL-1，42℃發(fā)酵至pH 4.8左右，分別在 4、20 °C 保存，0、3、6、9、12、15、18、21 d檢測(cè)pH和滴定酸度。

L15與 S18分別接種5.0×106cfu·mL-1，德氏乳桿菌保加利亞亞種L15-4與S18分別接種5.0×106cfu·mL-1，德氏乳桿菌保加利亞亞種LW-1與S18分別接種5.0×106cfu·mL-1，42 ℃發(fā)酵至pH 4.8左右，分別在4、20℃保存，0、3、6、9、12、15、18、21 d檢測(cè)pH和滴定酸度。

1.3.3 高密度發(fā)酵

以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37℃，5%接種量，脫脂乳、酵母粉、番茄汁3因素3水平，正交設(shè)計(jì)L9（33），方案見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一菌株發(fā)酵酸奶4℃儲(chǔ)存的后酸化

結(jié)果見(jiàn)圖1、2。

由圖1、2可知，單一桿菌5.0×106cfu·mL-1接種量條件下，4°C儲(chǔ)存L15后酸化最嚴(yán)重，12 d后pH降至4.16；21 d，pH降至4.10，滴定酸度增加340T；LW-1在4℃儲(chǔ)存21 d，pH降至4.29，滴定酸度增加240T；篩選菌株L15-44℃儲(chǔ)存21 d，pH降至4.40，滴定酸度增加200T。L15-4由于H+-ATPase活性弱，儲(chǔ)存時(shí)產(chǎn)酸能力降低，遠(yuǎn)低于親本L15，這是由于H+-ATPase參與維持細(xì)胞內(nèi)正常pH，H+-ATPase活性弱，外界H+濃度對(duì)L15-4影響更顯著，細(xì)胞代謝受阻，產(chǎn)酸能力降低，同時(shí)驗(yàn)證L15與對(duì)照組LW-1產(chǎn)酸能力差別，L15產(chǎn)酸能力更強(qiáng)，后酸化嚴(yán)重；篩選菌株L15-4后酸化能力弱于照組LW-1。

表1 增殖培養(yǎng)L9（33）試驗(yàn)方案Table1 Media of the multiplication to L9(33)

圖1 單一發(fā)酵劑4℃儲(chǔ)存pH變化Fig.1 pH variation of single starter fermented yogurt stored at 4℃

2.2 單一菌株發(fā)酵酸奶20℃儲(chǔ)存的后酸化

酸奶在有相對(duì)完整制冷設(shè)備條件下，儲(chǔ)存過(guò)程中，儲(chǔ)存溫度在4～10℃之間[10]，檢測(cè)在不完全具備制冷條件下，20℃儲(chǔ)存后酸化狀況，如圖3、4所示，20℃儲(chǔ)存L15后酸化比4℃更嚴(yán)重，21 d pH降至3.89，滴定酸度增加500T；LW-120℃儲(chǔ)存21 d pH降至4.06，滴定酸度增加390T；篩選菌株L15-4在20℃儲(chǔ)存21 d pH降至4.30，滴定酸度增加240T。雖然在20℃儲(chǔ)存條件下L15-4弱后酸化能力依然明顯，但L15-4在制作酸奶過(guò)程中，凝乳時(shí)間5 h，遠(yuǎn)高于親本及對(duì)照菌株LW-1。

2.3 混合菌株發(fā)酵酸奶4℃儲(chǔ)存的后酸化

圖2 單一發(fā)酵劑4℃儲(chǔ)存滴定酸度變化Fig.2 Titration acidity variation of single starter fermented yogurt stored at 4℃

混合球菌，分別接種5.0×106cfu·mL-1，在4℃儲(chǔ)存，如圖5、6所示:L15+S18混合菌株，21d儲(chǔ)存pH降至4.01，滴定酸度增加440T；LW-1+S18混合菌株21 d儲(chǔ)存pH降至4.14，滴定酸度增加310T；L15-4+S18混合菌株21 d儲(chǔ)存pH降至4.26，滴定酸度增加230T。酸奶是由保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵而來(lái)，二者彼此相互促進(jìn)生長(zhǎng)，混合菌株發(fā)酵酸奶與單一保加利亞乳桿菌發(fā)酵酸奶性質(zhì)不完全一致，然而混合菌株發(fā)酵，篩選菌株L15-4后酸化程度較親本低。

2.4 混合菌株發(fā)酵酸奶20℃儲(chǔ)存的后酸化

20℃儲(chǔ)存，混合菌株發(fā)酵，如圖7、8所示:L15+S18混合菌株，21 d儲(chǔ)存pH降至3.87，滴定酸度增加640T；LW-1+S18混合菌株21 d儲(chǔ)存pH降至4.02，滴定酸度增加410T；L15-4+S18混合菌株21 d儲(chǔ)存pH降至4.16，滴定酸度增加300T。模擬現(xiàn)實(shí)酸奶儲(chǔ)存條件，篩選菌株L15-4弱后酸化能力依然明顯。

圖3 單一發(fā)酵劑20℃儲(chǔ)存pH變化Fig.3 pH variation of single starter fermented yogurt stored at 20℃

圖4 單一發(fā)酵劑20℃儲(chǔ)存滴定酸度變化Fig.4 Titration acidity variation of single starter fermented yogurt stored at 20℃

圖5 混合發(fā)酵劑4℃儲(chǔ)存pH變化Fig.5 pH variation of fermentation with stored at 4℃

圖6 混合發(fā)酵劑4℃儲(chǔ)存滴定酸度變化Fig.6 Titration acidity variation of fermentation with stored at 4℃

圖7 混合發(fā)酵劑20℃儲(chǔ)存pH變化Fig.7 pH variation of fermentation with stored at 20℃

圖8 混合發(fā)酵劑20℃儲(chǔ)存滴定酸度變化Fig.8 Titration acidity variation of fermentation with stored at 20℃

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最適培養(yǎng)基

如表2所示，極差Rj的意義:Ki:i指某一特定因子第i個(gè)水平極差，Ki等于該因子第i個(gè)水平試驗(yàn)結(jié)果之和，Rj=K（最大值）-K（最小值），Rj越大，說(shuō)明該因素的水平變化對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，該因素越重要；反之，Rj越小，該因素越不重要。由此可以根據(jù)Rj的大小順序排出因素的主次，番茄汁是影響菌體高密度發(fā)酵的主要因素，脫脂乳次之，酵母粉對(duì)高密度發(fā)酵的影響最小。用正交表安排試驗(yàn)[12]，最佳培養(yǎng)基組合為5號(hào):脫脂乳3%，番茄汁5%，酵母粉0.5%，最高菌密度1.44×109cfu·mL-1。

表2 增殖培養(yǎng)L9（33）試驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of the multiplication to L9(33)

3 討論與結(jié)論

L15-4 H+-ATPase的活力比親本L15降低了60%，通過(guò)對(duì)新霉素篩選保加利亞乳桿菌菌株發(fā)酵酸奶，與親本、對(duì)照組比較，后酸化明顯減弱。H+-ATPase維持乳酸菌正常細(xì)胞內(nèi)pH和物質(zhì)運(yùn)輸，是乳酸菌正常生長(zhǎng)的重要酶[2]，并且保加利亞乳桿菌葡萄糖、谷氨酸鹽、天冬氨酸鹽等運(yùn)輸依賴(lài)H+-ATPase協(xié)助運(yùn)輸，H+-ATPase活性較弱，維持細(xì)胞內(nèi)外H+濃度差的能力降低，細(xì)胞外H+濃度變化對(duì)H+-ATPase型保加利亞乳桿菌抑制作用更明顯，并且小分子物質(zhì)運(yùn)輸能力降低，細(xì)胞正常代謝受到影響，所以保加利亞乳桿菌對(duì)環(huán)境條件變化更敏感，存儲(chǔ)時(shí)，不適宜pH條件，保加利亞乳桿菌對(duì)此反應(yīng)更強(qiáng)烈，產(chǎn)酸能力降低，所以H+-ATPase型保加利亞乳桿菌后酸化能力降低。同時(shí)L15-4發(fā)酵酸奶過(guò)程中產(chǎn)酸性能、高密度發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)性能受到H+-ATPase的活力的影響，相應(yīng)地降低。H+-ATPase弱化保加利亞乳桿菌高密度發(fā)酵時(shí)，最高菌密度達(dá)1.44×109cfu·mL-1，低于其親本2.15×109cfu·mL-1[13]。雖然L15-4 H+-ATPase活性降低帶來(lái)諸如:凝乳時(shí)間延長(zhǎng)，生產(chǎn)成本增加等不利因素，作為低檔酸奶發(fā)酵劑不具有優(yōu)勢(shì)，然而在益生菌產(chǎn)品中具有廣闊的應(yīng)用前景，益生菌產(chǎn)品市場(chǎng)將成為酸奶市場(chǎng)的主流產(chǎn)品，由于益生菌中雙歧桿菌的存活率受pH影響非常大[11]，H+-ATPase型保加利亞乳桿菌后酸化能力弱化，相應(yīng)提高益生菌產(chǎn)品中益生菌存活率，H+-ATPase型保加利亞乳桿菌生產(chǎn)成本高，凝乳時(shí)間長(zhǎng)，培養(yǎng)條件苛刻等不利條件的影響依然低于益生菌存活率提高帶來(lái)的收益。

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