曹麗萍,賈睿,丁煒東,殷國俊

(1.中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心,農業(yè)部水生動物遺傳育種和養(yǎng)殖生物學重點開放實驗室,江蘇無錫214081; 2.南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院,江蘇無錫214081)

五味子提取物對用t-BHP損傷的異育銀鯽原代肝細胞的影響

曹麗萍1,賈睿2,丁煒東1,殷國俊1

(1.中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心,農業(yè)部水生動物遺傳育種和養(yǎng)殖生物學重點開放實驗室,江蘇無錫214081; 2.南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院,江蘇無錫214081)

以叔丁基氫過氧化物(t-BHP)誘導異育銀鯽Carassius auratus gibel原代培養(yǎng)肝細胞損傷模型,采用不同的給藥順序,通過檢測肝細胞培養(yǎng)上清液中谷丙轉氨酶(ALT/GPT)、微量丙二醛(MDA)、谷光甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量以及肝細胞的增殖活性,研究了五味子提取物對急性肝細胞損傷的保護作用。結果表明:以濃度為1 mmoL/L的t-BHP作用肝細胞2 h誘導肝損傷模型,加入五味子提取物后能通過提高上清液中GSH-PX和SOD酶活力以及抑制脂質過氧化產物MDA的生成來減輕t-BHP對肝細胞的損傷,減少GPT的釋放,使GPT活力水平的升高受到明顯抑制,顯著提高了肝細胞的存活率(P＜0.05或P＜0.01);預防治療組(DT)中五味子提取物對損傷肝細胞的保護效果明顯要優(yōu)于預防組(D)和治療組(T)。說明五味子提取物對由t-BHP造成的肝細胞急性損傷具有一定的保護作用,該保護作用可能與其抗氧化、清除自由基的能力有關;中藥與損傷劑的給予順序會影響五味子提取物對肝細胞的保護作用。

異育銀鯽;五味子提取物;原代培養(yǎng);模型

近年來,魚類肝膽綜合癥在全國許多地區(qū)頻繁發(fā)生,給水產養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經濟損失。其病因多樣,目前還沒有有效的治療方法,各種抗生素、殺蟲劑和抗病毒藥物都不能有效地控制魚類肝膽綜合癥。因此,發(fā)展新的研究系統(tǒng)快速而深入地研究肝毒劑的毒理,篩選護肝藥物并探索其作用機理顯得尤為重要。近年來,研究發(fā)現(xiàn),一些中草藥具有免疫調節(jié)和保護肝臟的作用[1-2],且無毒、無害、成本低廉,在肝病的治療方面有良好的療效和巨大的潛力。

原代培養(yǎng)肝細胞作為護肝藥物體外研究體系,能較好地體現(xiàn)供體動物的生物學特性,實時地反映細胞層面的生命活動,實驗周期短,靈敏性及可復性好,所需藥物量少[3-5]。利用體外培養(yǎng)肝細胞的損傷模型對藥物進行生物活性、毒性評價、代謝特點等方面的研究已經廣泛應用于藥物研發(fā)過程中,并正在迅速發(fā)展[6]。國內研究原代培養(yǎng)異育銀鯽Carassius auratus gibelio肝細胞損害模型的報道尚不多見,在水產方面的研究和應用幾乎是空白。

五味子,為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis和華中五味子Schisandra sphenanthera的成熟果實,前者習稱北五味子。北五味子果實醇提物、種仁醇提取物能明顯降低實驗性肝損害所致的高血清轉氨酶[7-9]。從20世紀70年代起中國開始使用五味子治療慢性肝炎,取得了良好的療效。本試驗中,作者建立了以叔丁基氫過氧化物(t-BHP)誘導異育銀鯽原代培養(yǎng)肝細胞損傷模型,采用不同的給藥順序,通過檢測肝細胞培養(yǎng)上清液中一些生化指標以及肝細胞的增殖活性,研究了北五味子醇提取物對急性肝細胞損傷的保護作用,旨在

進一步篩選出對魚類既有保肝作用又有免疫調節(jié)作用的中草藥,為開發(fā)魚類免疫調節(jié)和保肝中草藥配方提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 五味子提取物 五味子提取物為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis的干燥成熟果實提取物,有效成分為木脂素類(如五味子醇甲、五味子乙素和五味子甲素及其它有機酸類),購自南通四海植物精華有限公司。

1.1.2 試驗魚 試驗用異育銀鯽(6月齡)取自中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心漁場,體質健康、無傷,體質量為150 g左右。將異育銀鯽飼養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)中,培養(yǎng)水溫為25℃,每天投喂2次商品飼料。

1.1.3 試劑和儀器 L-15培養(yǎng)基、HBSS(Hanks Balanced Saults)溶液、鏈霉素/青霉素(streptomycin/penicillin)和肝素(heparin)購于美國SIGMA公司;新生小牛血清(FCS)和細胞培養(yǎng)板購自于GIBCO公司;t-BHP(分析純)購于國藥集團化學試劑有限公司;GPT、MDA、GSH-PX和SOD測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所科技有限公司;723分光光度計購自上海欣茂儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 五味子提取物的配置 用FCS-L-15培養(yǎng)基(含100 IU/mL的S/P、10 U/mL的heparin和體積分數為5%的FCS)配成0.1、0.2和0.4 mg/mL的濃度,用0.22 μm的過濾器過濾,備用。

1.2.2 t-BHP的配置 t-BHP用CS-L-15培養(yǎng)基(含100 IU/mL的S/P、10 U/mL的heparin和體積分數為15%的CS)配成1 mmoL/L的濃度,用0.22 μm的過濾器過濾,備用。

1.2.3 異育銀鯽肝細胞的分離[10]隨機選取異育銀鯽,用MS-222麻醉后,去血。在超凈臺內,無菌條件下剖取異育銀鯽的肝臟,取適量肝組織放至培養(yǎng)皿中,用HBSS溶液洗至白色。將肝組織切成1 mm3的小塊,按5～10倍肝質量體積的比例加入質量分數為2.5%的胰酶消化液消化10～15 min,待肝組織的細胞分散成單個或大量小細胞團時加入FCS終止消化。過100目篩,剩下的組織塊可根據所需細胞數量對其再進行消化。將濾液轉入離心管中,于4℃下以1 000 r/min離心2 min,棄上清液,用HBSS溶液清洗沉淀以除去消化液,將沉淀懸浮后于4℃下進行梯度離心(60×g,30×g)5 min。用臺盼藍法進行細胞活性的檢測并計數,只有在活細胞數達到細胞總數的90%以上時,方可用于肝細胞損傷模型的構建和藥理研究。用CS-L -15培養(yǎng)基(含100 IU/mL的S/P、10 U/mL的heparin和體積分數為15%的CS)調整細胞濃度為106個/mL,接種到96孔板上,每孔100 μL,27℃下培養(yǎng)24 h后,備用。

1.2.4 t-BHP致肝原代細胞損傷及五味子提取物的保護處理 將肝細胞加入96孔板培養(yǎng)24 h后,棄上清液,在待用細胞中加入t-BHP和不同濃度的五味子提取物,造成肝細胞體外損傷并觀察五味子提取物對該模型的作用。各試驗組具體設置方法為:

1)空白對照組(C組),用L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)肝細胞,100 μL/孔,培養(yǎng)4 h后收集上清液;

2)t-BHP模型組(M組),用L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)肝細胞2 h后再換用含1 mmoL/L t-BHP的L-15培養(yǎng)基,100 μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后收集上清液;

3)預防組(五味子提取物的劑量分別為0.1、0.2、0.4 mg/mL,記為D1、D2、D3組),用含不同濃度五味子提取物的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h后,換用含1 mmoL/L的t-BHP的L-15培養(yǎng)基,100 μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后收集上清液;

4)治療組(五味子提取物的劑量分別為0.1、0.2、0.4 mg/mL,記為T1、T2、T3組):用含1 mmoL/L t-BHP的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h后,再換用含不同濃度五味子提取物的L-15培養(yǎng)基繼續(xù)培育2 h,100 μL/孔,收集上清液;

5)預防治療組(五味子提取物的劑量分別為0.1、0.2、0.4 mg/mL,記為DT1、DT2、DT3組),用含不同濃度五味子提取物的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h后,換用含1 mmoL/L t-BHP的L-15培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h,再換用含不同濃度五味子提取物的的L-15培養(yǎng)基培育2 h,收集上清液,100 μL/孔。以上每個實驗組均設8個重復孔,各組取上清液檢測生化指標。

1.2.5 谷丙轉氨酶(ALT/GPT)、微量丙二醛(MDA)、谷光甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)含量的測定 將異育銀鯽的血清分離后,用0.22 μm的過濾器過濾,滅能后備用,按照GPT、MDA、GSH-PX和SOD測定試劑盒的方法測定。

1.2.6 用MTT法檢測細胞生長活力[11]C組、M組和D1～D3組收集上清液后,將96孔細胞板移至離心機上離心10 min(350×g),傾去上清液,每孔加100 μL體積分數為5%的FCS-L-15和20 μL MTT,于27℃下繼續(xù)培育4 h。傾去上清液,每孔加150 μL DMSO,振蕩10 min,使結晶物充分溶解,選擇570 nm波長,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值,記錄結果。

細胞存活率按下列公式[12]計算:

1.3 數據分析

谷丙轉氨酶(ALT/GPT)、微量丙二醛(MDA)、谷光甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶活力測定及數據分析按照試劑盒操作說明進行。實驗數據用平均值±標準誤表示,數據分析采用SPSS 15軟件包中的單因素方差分析(one-way-ANOVA)處理,對樣本之間進行t檢驗。顯著性水平設為0.05和0.01。

2 結果

2.1 五味子提取物對損傷肝細胞培養(yǎng)上清液中生化指標的影響

2.1.1 五味子提取物對損傷肝細胞培養(yǎng)上清液中GPT的影響 將低、中、高濃度的五味子提取物和t-BHP以不同順序作用于體外培養(yǎng)的原代肝細胞,培養(yǎng)上清液中GPT的變化如圖1所示。從圖1可見:用t-BHP損傷肝細胞后,促進了肝細胞內GPT酶的釋放,模型損傷組(M組)培養(yǎng)上清液中GPT的水平較空白對照組(C組)明顯升高,差異極顯著(P＜0.01),表明模型建立成功;與模型組(M組)比較,預防組內五味子提取物濃度為0.2 mg/mL(D2組)和0.4 mg/mL(D3組)、治療組內五味子提取物濃度為0.2 mg/mL(T2組)以及預防治療組內(DT1～DT3組)不同劑量的五味子提取物均能抑制GPT水平的升高(P＜0.01或P＜0.05)。

2.1.2 五味子提取物對損傷肝細胞培養(yǎng)上清液中MDA、SOD及GSH-PX的影響 將低、中、高濃度的五味子提取物和t-BHP以不同的順序作用于體外培養(yǎng)的原代肝細胞,培養(yǎng)上清液中MDA、SOD及GSH-PX的變化見圖1。從圖1可見:用t-BHP損傷肝細胞的M組較空白組(C組)培養(yǎng)上清液中的MDA含量明顯升高,SOD和GSH-PX則極顯著降低(P＜0.01),表明模型建立成功;與模型組(M組)比較,預防組(D1～D3組)不同濃度的五味子提取物均能顯著提高GSH-PX活性(P＜0.05),對抑制MDA活性和提高SOD活性卻沒有明顯作用;治療組較模型組除五味子提取物濃度為0.2 mg/mL的T2組能有效地提高GSH-PX活性(P＜0.05)外,其它濃度組對提高SOD水平、抑制MDA活性均無明顯差異(P＞0.05);與模型組比較,預防治療組(DT1～DT3組)各濃度的五味子提取物均能顯著提高SOD和GSH-PX水平(P＜0.05或P＜0.01),0.2 mg/mL的五味子提取物還能顯著降低上清液中MDA的水平(P＜0.05)。

2.2 五味子提取物對肝細胞增殖活性的影響

用t-BHP誘導肝細胞損傷后2 h,在倒置顯微鏡下觀察可見,部分肝細胞形態(tài)發(fā)生改變,胞膜粗糙并部分破裂,細胞器腫脹,核固縮或核破裂,部分細胞壞死或變形。中藥處理組肝細胞壞死明顯減少,形態(tài)大部分正常,細胞核清晰可見(圖2)。

用MTT法測定了各處理組肝細胞的存活率,結果表明,用t-BHP損傷后的模型組細胞活性明顯下降,僅為正常組的43.34%;而五味子提取物預防組的肝細胞存活率明顯上升,0.1、0.2 mg/mL和0.4 mg/mL劑量組的肝細胞存活率分別為80.77%、90.05%和87.49%,與t-BHP模型組相比,差異極顯著(P＜0.01)(表1)。

表1 五味子提取物對肝細胞存活率的影響Tab.1 Effect of Schisandrins extracts on cell viability

圖1 五味子提取物對用t-BHP損傷的肝細胞培養(yǎng)上清液中GPT、MDA、GSH-PX和SOD的影響Fig.1 Influences of Schisandrins extracts on the levels of GPT,MDA,GSH-PX,and SOD in supernatant of cultured hepatocytes injured by t-BHP

圖2 離體肝細胞的形態(tài)觀察(×200)Fig.2 Morphological observation of the hepatocytes in crucian carp in vitro(×200)

3 討論

在多種肝病(包括炎癥/免疫介導肝細胞損傷、酒精和化學藥物性肝損傷及缺血再灌注性肝損傷等)的肝細胞損傷中,多種酶、自由基以及脂質過氧化反應均發(fā)生較大的變化[13-15],氧化應激是它們的共同損傷機制。在肝損傷的病變過程中,氧化應激及自由基引起的氧化損傷主要由活性氧化物質和活性氮化物所致,它們是細胞代謝過程中產生的含氧或含氮的活性產物,可通過脂質過氧化等途徑誘導組織細胞損傷,具有重要的生理和病理作用。氧化物質t-BHP雖不是自由基,但它屬活性氧類,有高反應性,可促進自由基的生成,引發(fā)生物膜的脂質過氧化反應,導致細胞的壞死和凋亡[16]。

GPT是肝內的主要功能酶,在肝臟組織損傷及壞死時,酶從細胞內溢出進入細胞培養(yǎng)上清液中,使得相關轉氨酶的水平顯著升高。本研究中,將含1 mmoL/L t-BHP的L-15培養(yǎng)基作用于異育銀鯽肝細胞2 h后,促進了GPT的釋放,其含量顯著升高,同時各藥物組均能抑制GPT水平的升高。齊彥等[17]的研究結果表明,北五味子醇提物能夠顯著降低由CCL4引起的小鼠肝中GPT的增高;胡彥武[18]觀察了五味子藤莖對小鼠酒精性肝損傷后血清中GPT、GOT的影響時也發(fā)現(xiàn),五味子藤莖通過降低血清中轉氨酶水平來有效防治小鼠酒精性肝損傷。本試驗結果與齊彥等[17]和胡彥武[18]的研究結果相同。

MDA是細胞膜脂質過氧化反應的終產物[19],細胞中MDA含量的多少可反映細胞脂質過氧化的損傷程度[20-21]。本研究中,用t-BHP損傷肝細胞后,培養(yǎng)上清液中MDA的含量明顯升高;預防治療組,0.2 mg/mL的五味子提取物能顯著降低上清液中MDA的水平。陳榮華等[22]在研究五味子醇提殘渣中粗多糖的體外抗氧化活性時也得出了相似的結論,即五味子粗多糖能顯著降低小鼠肝勻漿液中MDA的生成,具有良好的體外抗氧化作用;劉玉芹[23]在研究中藥配伍對肉雞抗氧化指標的影響時發(fā)現(xiàn),五味子同樣可降低肉雞血清中MDA含量。

SOD、GSH-PX是細胞內源性重要的抗氧化劑,其含量多少是衡量細胞抗氧化能力的重要指標。當體內代謝過程中產生自由基時,SOD可與其反應產生HO,HO與GSH在GSH-PX催化下生成水,從而使自由基清除[24]。本研究中發(fā)現(xiàn),預防治療組內各濃度的五味子提取物均能顯著提高SOD和GSH-PX水平,表明了五味子在異育銀鯽抗t-BHP誘導肝損傷中的重要作用。燕菲等[25]在研究五味子與黃芪多糖對小鼠急性肝損傷的協(xié)同保護作用時也有類似的闡述,即五味子提取物和黃芪多糖通過協(xié)同作用提高了對乙酰氨基酚致肝損傷小鼠肝臟的還原性谷胱甘肽和抗氧化水平,降低了血清中GOT和GPT水平,減輕了對肝組織細胞的損傷。

本試驗中以t-BHP為損傷劑成功建立了異育銀鯽肝細胞體外損傷模型,研究五味子提取物對急性肝細胞損傷的保護作用。結果顯示:五味子提取物能通過提高GSH-PX和SOD酶活力以及抑制脂質過氧化產物MDA的生成來減輕t-BHP對肝細胞的損傷,減少GPT的釋放,使GPT活力水平的升高受到明顯抑制,顯著提高肝細胞的存活率,顯示出對t-BHP造成的肝細胞急性損傷具有一定的保護作用,且該保護作用可能與其抗氧化和清除自由基的能力有關。本試驗結果為進一步了解五味子提取物對損傷肝細胞保護的藥理作用機制及篩選更多的中草藥提供了基礎資料,但五味子醇提取物中各具體成分的保肝藥理還需進一步的研究。

本研究中還發(fā)現(xiàn),中藥與損傷劑的給予順序會影響五味子提取物對肝細胞的保護作用。從對生化指標的測定值中可以看出,預防治療組中五味子提取物對損傷肝細胞的保護效果明顯要優(yōu)于預防組和治療組,這可能與草藥作用的時間長短有關。而預防組的保護效果較治療組更加明顯,可能是五味子提取物對肝損傷的預防作用比治療作用更重要。

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Protective effects of schisandrins extracts on injuried primary cultured hepatocytes induced by t-BHP in crucian carp Carassius auratus gibel

CAO Li-ping1,JIA Rui2,DING Wei-dong1,YIN Guo-jun1
(1.Key Open Laboratory for Genetic Breeding of Aquatic Animals and Aquaculture Biology,Ministry of Agriculture,Freshwater Fisheries Research Center,Chinese Academy of Fishery Sciences,Wuxi 214081,China;2.Wuxi Fisheries College,Nanjing Agricultural University,Wuxi 214081,China)

The activities of inhibiting alanine minotransferase(GPT),malondisldehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD),and glutathione peroxidas(GSH-PX)in cell culture supernatants and the survival rate of the injuried hepatocytes in vitro induced by t-BHP and then exposed to various concentrations of Schisandrins extracts (0.1,0.2 and 0.4 mg/mL)before(defense),after(treatment)and both before and after(defense-treatment) the culture were determined in the crucian carp Carassius auratus gibel to study on the protective and antioxidant effects of the Schisandrins extract.The model of acute hepatopancreatic damage was found to be established by exposure to 1 mmoL/L t-BHP for 2 h.The extracts were found to reduce the injury of hepatopancrease by increasing the activity of glutathione peroxidas(GSH-PX)and superoxide dismutase(SOD),restraining the lipid peroxidation production-malondisldehyde(MDA),inhibiting alanine minotransferase(GPT),to release and to remarkably improve the survival of the hepatocytes(P＜0.05,or P＜0.01)in the supernatant of cultured hepatocytes injured by t-BHP induction.It is concluded that the Schisandrins extracts possess direct protective effect on primary hepatocyte injury induced by t-BHP,which is primarily involved in the scavenging oxygen free radicals and anti-oxidative activity of CMPS.The biochemical indicators showed that the protection of the extracts were significantly better in the defense-treatment group(DT)than that in the defense group(D)and treatment group(T).

Carassius auratus gibel;Schisandrins extract;primary culture;model

2095-1388(2011)03-0197-06

S917

A

2010-08-29

科技部國際科技合作項目(2009DFA32620);江蘇省國際科技合作計劃(BZ2008008);無錫市科技計劃(國際科技合作) (CZE00906);中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金(中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心)資助項目(2011JBFC05);廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室開放基金課題(LFE-2009-02)

曹麗萍(1977-),女,助理研究員。E-mail:caolp@ffrc.cn

殷國俊,男,研究員。E-mail:yingj@ffrc.cn