周佳雁綜述 馬向華審校

脂肪源性干細胞(ADSCs)用于血管再生性治療的研究進展

周佳雁綜述 馬向華審校

當組織發(fā)生缺血性病變時,機體會以自發(fā)生成新血管方式緩解缺血缺氧、延緩疾病進展。但是,在一些存在動脈粥樣硬化危險因素及其他全身性疾病的患者,機體的這種自發(fā)血管生成機制受到限制。因而需研究針對這種缺血性疾病的新治療方法——“血管再生性治療”,而在大部分實驗和臨床前研究中主要采用干細胞移植。本文就脂肪源性干細胞(Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs)用于血管再生治療的研究進展作一綜述。

1 ADSCs的特點及其促血管生成研究

1.1 干細胞的選擇及ADSCs的特點

成人的血管再生可以動員骨髓中的內皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)和間充質干細胞(Bone M arrow-derived M esenchymal Stem Cells,BM-MSCs)來完成,通過骨髓動員的EPCs進入外周循環(huán)中,最后至遠端器官而發(fā)揮促血管再生作用。研究表明EPCs能對內皮損傷產生應答作用[1];移植培養(yǎng)的EPCs參與新生血管形成及損傷的動脈血管壁再內皮化也獲得成功。但因EPCs的培養(yǎng)很困難,自我更新能力較差等缺陷[2],使其在臨床研究中受到限制。BM-MSCs是目前關注較多的干細胞,且動物模型及臨床應用均證實通過移植BM-MSCs至缺血骨骼肌可成功促使血管形成[3]。但自體移植BM-MSCs治療缺血性疾病存在很多限制因素,如操作方法的侵襲性太大,促使血管形成的機制目前尚不成熟,臨床試驗顯示這種方法對治療周圍血管閉塞性疾病晚期患者效果較差[4]。因此,近年來越來越多的學者開始尋求新的干細胞。

國外研究資料[5]顯示,脂肪組織中含有大量能夠貼壁培養(yǎng)、快速增殖、具有多向分化潛能的間充質干細胞ADSCs,且來源廣泛、便利,對供者的損傷也小,即使是很少量的人皮下脂肪組織,都可以分離出這種細胞,并且可以培養(yǎng)擴增[6]。有報道稱,從2006年起,美國每年經脂肪抽吸術獲得且沒有妥善利用的皮下脂肪組織超過3L[7],而經過提純可獲得的ADSCs約為400 000個細胞/m l[8]。因此,自體皮下脂肪是很好的干細胞來源。Peroni等[9]發(fā)現(xiàn)60種同時參與人ADSCs及人BM-MSCs基因組的基因,都能影響組織生長、修復及內環(huán)境的穩(wěn)態(tài);也有研究發(fā)現(xiàn)[10～13]ADSCs與 BMMSCs相似,亦可分化為成骨細胞、軟骨細胞、神經細胞、肌細胞等。因此,很多關于ADSCs促血管再生治療缺血性疾病的研究正逐漸開展。

1.2 ADSCs促血管再生的研究現(xiàn)狀

國內外大量研究顯示ADSCs可以促血管形成,從而成功治療缺血性疾病。M adonna等[14]在體外將鼠ADSCs分別接種于甲基纖維素培養(yǎng)基Methocu lt M 3534及基質膠(Matrigel)上,培養(yǎng)過程中均出現(xiàn)接種的ADSCs形成分支管狀的結構網(wǎng)。Kang等[15]認為ADSCs可有效促使內皮細胞增殖,促新生血管形成。M iranville等[16]將ADSCs肌肉注射至小鼠缺血下肢,移植后局部血流量明顯改善,且局部毛細血管密度顯著增加。Kondo等[17]在下肢缺血的小鼠模型中以肌肉注射磷酸鹽緩沖溶液為對照,分別肌肉注射ADSCs及成熟脂肪細胞(M As),結果顯示移植ADSCs組血流灌注得到更好的改善。但有趣的是,相對于注射磷酸緩沖溶液組,肌注M As組促血管生成的能力更差。研究其原因可能呈 MA s分泌的一些細胞因子,包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白介素-6(IL-6)等,在MAs促血管形成中起到負性調節(jié)作用[18]。Hong等[19]報道的早期臨床試驗結果顯示,ADSCs通過促血管形成、改善局部血供,可緩解很多缺血性疾病的發(fā)生、發(fā)展,包括急性心肌梗死、周圍血管性疾病、骨及軟組織損傷、Crohn's瘺管、皮膚損傷。

2 ADSCs促血管再生的機制

關于ADSCs治療缺血性疾病的機制,目前尚存爭議。

2.1 ADSCs分化為內皮系細胞促血管形成

以往研究均顯示,移植的ADSCs是在體內分化為內皮系細胞,如EPCs或成熟內皮細胞(ECs),從而成功治療缺血性疾病。如Fischer等[20]將 ADSCs置于含 50μg/m l牛下丘腦提取物ECDS(一種內皮細胞生成添加劑)的內皮細胞培養(yǎng)基中,并予以適當?shù)募羟辛?發(fā)現(xiàn)ADSCs可以分化為內皮系細胞;Brzoska等[21]在ADSCs培養(yǎng)過程中加入全反式維甲酸二甲基亞砜,亦得到內皮系細胞;國內很多學者[22,23]使用血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維生長因子(b-FGF)在體外誘導ADSCs向內皮細胞分化也均已獲得成功。

但是近年來國外一些研究指出,脂肪組織中存在另一種間充質細胞,即血管間充質細胞(SVF),其包含了多能間充質干細胞/祖細胞(包括成纖維細胞、脂肪細胞、周細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞),從而可以分化為不同的細胞系,因此,即使ADSCs在體外及體內實驗成功分化為內皮細胞,仍不能排除SVF在其中的干擾作用。Traktuev等[18]研究發(fā)現(xiàn)使用內皮細胞培養(yǎng)基 EGM-2不能將人ADSCs分化為ECs。M urohara[24]為模型動物移植綠色熒光蛋白(GFP)標記的ADSCs,發(fā)現(xiàn)移植的ADSCs不能表達內皮細胞標志物。因此,目前關于ADSCs是否能向內皮系細胞分化,尚存爭議。

2.2 ADSCs通過旁分泌細胞因子促血管形成

近年來很多研究顯示ADSCs可分泌促血管生長因子,如肝細胞生長因子(Hepatocyte Grow th Factor,HGF)、基質衍生因 子-1(Stromal-Cell Derived Factor-1,SDF-1)、VEGF[24～26]等。Rehman等[27]研究發(fā)現(xiàn)每 106個 ADSCs可分泌1 203±254 pg VEGF,若將 ADSCs置于缺氧環(huán)境中,ADSCs分泌VEGF水平可增加5倍左右,移植處內皮細胞呈現(xiàn)顯著增殖(P＜0.001),且凋亡明顯減少(P＜0.05)。有研究顯示,VEGF-A介導的促血管生成作用呈部分依賴SDF-1及其趨化因子受體 4(CXCR4)途徑的激活[28,29]。

2.2.1 HGF:最初認為HGF是特異作用于肝細胞的細胞因子,近年來越來越多的研究顯示HGF具有促有絲分裂、促血管形成、抗凋亡等多種作用,可作用于多種不同的細胞[30-31]。以往有報道稱,在外周缺血模型中應用ADSCs加速再灌注或進行組織補救時,ADSC可分泌生理水平的HGF。Zhu等[32]發(fā)現(xiàn),移植后的 ADSCs分泌的 HGF在血管形成過程中起到重要促進作用,經HGF基因轉導后ADSCs的促血管形成、改善血供的能力顯著增加。Cai等[33]報道,敲除HGF基因后ADSCs促外周缺血組織再灌注能力下降,由此引起局部微血管密度下降?？梢夾DSCs分泌的HGF對ADSCs的功能有很重要的影響。

2.2.2 SDF-1:SDF-1是一種趨化因子,最初從BM-MSCs骨髓間充質干細胞中分離。Tang等[34]證實SDF-1可增強干細胞在缺血疾病中的療效。Kondo等[17]在下肢缺血動物模型中以肌肉注射磷酸鹽緩沖溶液為對照,移植ADSCs,發(fā)現(xiàn)經ADSCs治療后小鼠體內SDF-1 mRNA及其相關蛋白水平顯著升高,且缺血下肢的血流灌注得到明顯改善;但隨后予以SDF-1單克隆抗體干預后,ADSCs的療效顯著下降。

SDF-1的主要受體為CXCR4,后者大量表達于骨髓細胞,這就使得SDF-1有廣泛的效應細胞。Heissig等[35]研究發(fā)現(xiàn)SDF-1可動員CXCR4+的骨髓細胞,其中包括造血干細胞(HSCs)和EPCs。Kondo等[17]在下肢缺血的小鼠模型中移植ADSCs后,發(fā)現(xiàn)骨髓 EPCs含量明顯增加,由此認為SDF-1可動員EPCs。

目前研究顯示,與血管形成相關的受體主要為VEGF受體(VEGFR)、CXCR4+、酪氨酸蛋白激酶生長因子受體(c-Kit),在分別經其配體 VEGF-A、SDF-1、K it配體(KitL)激活后可發(fā)揮促血管生成作用。但有研究稱VEGF-A[29,34]與c-Kit促血管形成作用呈部分SDF-1-CXCR4+途徑激活依賴性。

SDF-1由ADSCs釋放后進入外周血,通過復雜的胞吞[36]作用,從外周血中轉運至骨髓腔內,進而激活基質金屬蛋白酶-9(MMP-9),促使可溶性kit配體(sKitL)釋放。隨后,sKitL介導更多的SDF-1釋放,從而增強對CXCR4+及C-K it++細胞的動員作用,使其進入外周血[35]。另外,一氧化氮(NO)途徑亦可擴大SDF-1作用。SDF-1可促使內皮細胞釋放NO,使MMP-9水平上調。A icher等[37]在敲除一氧化氮合成酶(NOS)的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)其MMP-9的激活、sK itL的釋放及促血管生成細胞均受損,由此可見NO在SDF-1介導的骨髓細胞動員中起到十分重要的作用。

2.2.3 骨髓衍生循環(huán)細胞(RBCCs):ADSCs旁分泌SDF-1使得局部 SDF-1含量增多,從而使 VEGF表達上調,而VEGF亦可反作用增加 SDF-1及 CXCR4的表達[38]。VEGF-SDF-1促血管生成作用的主要步驟包括動員、轉移、募集至局部缺血部位、粘附、侵襲、捕獲及滯留 RBCCs。在這一過程中,VEGF及SDF-1起著核心作用。局部表達的VEGF可捕獲 RBCCs,刺激血管原位ECs增殖。SDF-1可增強VEGF介導的內皮型NOS(eNOS)合成的相關通路,同時亦可募集CXCR+RBCCs。更重要的是,SDF-1可滯留募集的細胞,將這些細胞準確定位在新生血管周圍組織,從而進一步放大其促血管形成作用。募集并定位于缺血部位的RBCCs通過分泌血管生成因子[39],促使血管壁內皮細胞生長,改善局部血流灌注。

3 ADSCs在血管再生性治療中的問題

雖然在體外培養(yǎng)及動物模型中均已證實ADSCs移植后可促使血管形成、改善局部血流灌注,治療缺血性疾病。但是目前關于ADSCs臨床應用前的研究仍存在很多尚待解決的問題。

3.1 ADSCs的移植數(shù)量

在BM-M SCs促血管再生的動物模型研究中發(fā)現(xiàn),注射過多的細胞會導致一些負作用,因此有必要研究注射移植ADSCs的最有效劑量。

3.2 ADSCs的分離方法

近年來報道的分離方法是將ADSCs予以膠原酶消化,隨后使用特定的裝備進行機械離心分離。這種方法在整形外科手術中的脂肪組織再生中被證明是十分有效的[40,41],且不需要細胞培養(yǎng)系統(tǒng)及不需要建立細胞加工中心。如果兩種類型的ADSCs,即新分離的ADSCs和培養(yǎng)后的ADSCs在促血管分化能力上具有相似的能力,則有必要選擇使用一種機械裝備來進行血管形成性治療。3.3 缺血性疾病移植ADSCs的療效評估

ADSCs的數(shù)量及功能與患者存在的并發(fā)癥及動脈粥樣硬化等危險因素相關,例如在2型糖尿病[42]中SDF-1的分泌水平降低;存在多種危險因素包括糖尿病、高血壓、高齡、吸煙等的患者,其體內的祖細胞數(shù)量和功能降低。這些病癥通常存在于周圍動脈閉塞性疾病及血管閉塞性脈管炎(Buerger's疾病)患者。但現(xiàn)在尚未明確ADSCs的數(shù)量及功能是否一定會受這些危險因素的影響。因此,在使用促血管形成的治療學方法前,應該對這些問題進行評估。

4 小結與展望

ADSCs來源廣泛、取材方便,且體內、體外實驗均證實可通過促血管形成、改善局部血供,緩解很多缺血性疾病的發(fā)生、發(fā)展,因此受到越來越多的研究者關注,成為可替代BM-MSCs的新的干細胞治療手段。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)ADSCs可分泌大量促血管生成的細胞因子,但具體機制尚待進一步明確。雖然目前在ADSCs臨床應用中還有許多尚待解決的實際問題,但隨著研究的進一步深入,相信在未來,ADSCs可為缺血性疾病的治療帶來新的希望。

本文第一作者簡介:

周佳雁(1985～),女,漢族,碩士研究生

1 Hill JM,ZalosG,SchenkeWH,et al.Circulating endothelial progenitor cells,vascu lar function,and cardiovascular risk.New England Journal of Medicine,2003,348(7):593～600.

2 Mu rohara T.Au tologous adipose tissue as a new source of progenitor cells for therapeutic angiogenesis.Journal of Cardiology,2009,53(2):155～163.

3 Kajiguchi M,Kondo T,Izaw a H,et al.Safety and efficacy of autologousprogenitor cell transplan tation for therapeuticangiogenesis in patients with critical lim b ischem ia.Circu lation Journal,2007,71(2):196～201.

4 Kajiguchi M,Kondo T,Izaw a H,et al.Safety and efficacy of autologous progenitor cell transplan tation for therapeutic angiogenesis in patients with critical lim b ischemia.Circu lation Journal,2007,71(2):196～201.

5 Gimb le1 JM,Guilak F.Adipose-derived adu lt stem cells:isolation,characterization and differentiation potential.Cytotherapy,2003,5(5):362.

6 M iyazaki T,K itagaw a Y,Toriyama K,et al.Isolation of tw o human fibroblastic cell populations with multiple but distinct potential ofmesenchymaldifferentiation by ceiling cu lture ofm ature fat cells from sub cutaneous adipose tissue.Differen tiation,2005,73(2-3):69～78.

7 Bunnell BA,Flaat M,Gagliardi C,et al.Adipose-derived stem cells:isolation,expansion and differentiation.Methods,2008,45(2):115～120.

8 Zuk PA,Zhu M,Ashjian P,et al.H uman adipose tissue isa source ofmultipotent stem cells.M olecular Biology of the Cell,2002,13(12):4 279～4 295.

9 Peroni D,Scambi I,Pasini A,et al.Stem molecular signatu re of adipose-derived stromal cells.Experimental Cell Research,2008,314(3):603～615.

10 Mahmoudifar N,Do ran PM.Extent of cell differentiation and capacity for cartilage synthesis in human adult adipose-derived stem cells:comparison with fetal chondrocytes.Biotechnology and bioengineering,2010,107(2):393～401.

11 Golipoor Z,Kashani IR,Akbari M,et al.Differentiation of adipose-derived stem cells into schw ann cell phenotype in comparison with bone marrow stem cells.Iranian Jou rnal of Basic Scien ce,2010,13(3):76～84.

12 Yoon E,Dhar S,Chun DE.In vivo osteogenic potential of human adipose-derived stem cells/poly lactide-co-glycolicacid constru cts for bone regeneration in rat critical-sized calvarial defectm odel.Tissue Engineering,2007,13(3):619～627.

13 Vieira NM,Brandalise V,Zucconi E,et al.H uman m ultipotent adipose-derived stem cells restore dy strophin ex pression of Duchenne skeletal-muscle cells in vitro.Biology of the cell,2008,100(4):231～241.

14 M adonna R,Caterina R.In vitro neovascu logenic poten tial of resident adipose tissue precu rsors.Am erican Journalof Physiology Cell Physiology,2008,295(5):1 271～1 280.

15 Kang Y,Park C,K im D,et al.Unsorted human adipose tissuederived stem cells promote angiogenesis and myogenesis in murine ischemic hindlimb model.M icrovascular Research,2010,80(3):310～316.

16 M iranville A,H eeschen C,Sengenes C,et al.Im provement of postnatal neovascularization by human adipose tissue derived stem cells.Circulation,2004,110(3):349～355.

17 Kondo K,Shin tani S,Shibata R,et al.Im plantation of adiposederived regenerative cells enhances ischem ia-induced angiogenesis.A rteriosc ler Thrombosisand Vascular Biology,2009,29(1):61～66.

18 T rak tuev D,Merfeld CS,Li J,et al.A population ofm ultipotent CD 34-positive adipose strom al cells share pericyte and mesenchym al su rfacemarkers,reside in a periendothelial location,and stabilize endothelial netw orks.Circu lation Research,2008,102(1):77～85.

19 H ong SJ,T rak tuev DO,M arch KL.Therapeutic poten tial of adipose-derived stem cells in vascular grow th and tissue repair.Current Opinion in Organ T ransplantation,2010,15(1):86～91.

20 Fischer LJ,M cilhenny S,Tulenko T,et al.Endothelial differentiation of adipose-derived stem cells:effects of endothelial cell grow th supp lement and shear force.Jou rnal of Surgical Re-search,2009,152(1):157～166.

21 Brzoska M,Geiger H,Gauer S,et al.Epithelial differen tiation of hum an adipose tissue-derived adult stem cells.Biochemical and Biophysical Research Communications,2005,330(1):142～150.

22 薛 君,邊云飛,郭澤君.體外誘導人脂肪干細胞向內皮細胞分化的研究.中國分子心臟病學雜志,2009,9(1):24～27.

23 管利東,李紹青,王韞芳.人脂肪間充質干細胞體外血管內皮細胞分化.科學通報,2006,51(13):1 536～1 540.

24 Mu rohara T.Autologous adipose tissue as a new source of progenitor cells for therapeutic angiogenesis.Jou rnalof Cardiology,2009,53(2):155～163.

25 Nakagam i H,M aeda K,M orishita R,et al.Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease th rough g row th factor secretion by cultu red adipose tissue-derived stromal cells.A rteriosclerosis Thrombosisand Vascular Biology,2005,25(12):2 542～2 547.

26 Sum i M,Sata M,Toya N,et al.Transplantation of adipose stromal cells,bu t notm ature adipocy tes,augments ischem ia-induced angiogenesis.Life Science,2007,80(6):559～565.

27 Rehman J,Traktuev D,Li J,et al.Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose strom al cells.Circulation,2004,109(10):1 292～1 298.

28 Jin DK,Shido K,Kopp HG,et al.Cy tokine-mediated deploym ent of SDF-1 induces revascularization th rough recruitm ent of CXCR4 hemangiocytes.Nature Medicine,2006,12(5):557～567.

29 Grunew ald M,Avraham I,Dor Y,et al.VEGF-indu ced adult neovascularization:recruitment,reten tion,and role of accessory cells.Cell,2006,124(1):175～189.

30 Bell LN,Cai L,Johnstone BH,et al.A cen tral role fo r hepatocyte grow th factor in adipose tissue angiogenesis.American Jou rnal of Physiology Endocrinology and Metabolism,2008,294(2):E336～E344.

31 Inagaki Y,Higashi K,Kushida M,et al.H epatocyte grow th factor supp resses profibrogenic signal transduction via nuclear export of sm ad3 with galectin-7.Gastroenterology,2008,134(4):1 180～1 190.

32 Zhu XY,Zhang XZ,Xu L,et al.Transplantation of adipose-derived stem cells overex pressing hHGF into cardiac tissue.Biochem ical and Biophysical Research Communications,2009,379(4):1 084～1 090.

33 Cai L,Johnstone BH,Cook TG,et al.Suppression of hepatocyte grow th factor production im pairs the ability of adipose-derived stem cells to promote ischem ic tissue revascularization.Stem Cells,2007,25(12):3 234～3 243.

34 Tang J,Wang J,Zheng F,et al.Combination of chemokine and angiogenic factor genes and mesenchym al stem cells could enhance angiogenesis and im provecardiac function after acu temyocardial infarction in rats.Molecular and Cellular Biochem istry,2010,339(1-2):107～108.

35 H eissig B,H attoriK,Dias S,etal.Recruitmen t of stem and progenito r cells from the bonemarrow niche requiresMMP-9mediated release of kit-ligand.Cell,2002,109(5):625～637.

36 Dar A,Goichberg P,Shinder V,et al.Chemokine recep tor CXCR4-dependent in ternalization and resecretion of functional chemokine SDF-1 by bonem arrow endothelial and stromalcells.Nature Immunology,2005,6(10):1 038～1 046.

37 A icher A,Heeschen C,M ildner RC,et al.Essential role of endothelial nitric oxide synthase form obilization of stem and p rogenitor cells.Natu re Medicine,2003,9(11):1 370～1 376.

38 Isabelle P,David J,Shahin R,et al.The SDF-1 CXCR4 signaling pathway:amolecu lar hub modulating neo-angiogenesis.Trends in Immunology,2007,28(7):299～307.

39 Ruiz D,A lm odovar C,Lu ttun A,et al.A n SDF-1 trap for myeloid cells stimulates Angiogenesis.Cell,2006,124(1):18～21.

40 Fraser JK,Wu lur I,A lfonso Z,et al.Fat tissue:an underapp reciated source of stem cells for biotechnology.T rends in Biotechnology,2006,24(4):150～154.

41 Moseley TA,Zhu M,H edrick M H.Adipose-derived stem and progenitor cells as fillers in plastic and reconstructive su rgery.Plast and Reconstru ctive Surgery,2006,118(3):S121～S128.

42 Gallagher KA,Liu ZJ,Xiao M,et al.Diabetic impairments in NO-mediated endothelial progenitor cellmobilization and hom ing are reversed by hyperoxia and SDF-1α.Jou rnal of Clinical Investigation,2007,117(5):1 249～1 259.

R318.06 R331.3+2

A

1005-1740(2011)01-0066-04

江蘇省人民醫(yī)院內分泌科,郵政編碼 南京 210029本文2010-09-14收到,2010-11-26修回,2010-11-30接受