張敏文，顧取良，張博，李荷

(廣東藥學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，廣東廣州510006)

1 乳糖酶的來源及其特性

乳糖酶存在于植物、細(xì)菌、真菌、放線菌以及哺乳動物(特別是嬰兒)的腸道中。目前只有來源于微生物的乳糖酶有工業(yè)應(yīng)用價值，利用微生物發(fā)酵法制取乳糖酶，具有酶源豐富、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、周期短的特點(diǎn)，而且不受季節(jié)、地理位置等因素的影響，不同微生物來源的乳糖酶的性質(zhì)差別較大(表1)。

2 乳糖酶的基礎(chǔ)研究

2.1 乳糖酶的基本結(jié)構(gòu)及其生物合成

對乳糖起水解作用的酶是乳糖酶根皮苷水解酶(lactase phlorizin hydrolase，LPH)。LPH是一種腸上皮細(xì)胞微絨毛膜上的糖蛋白，具有乳糖酶和根皮苷水解酶活性，最適pH為5.5～6.0。LPH為一條多肽鏈，有乳糖酶和根皮苷水解酶的作用位點(diǎn)，并通過COOH末端的一段疏水氨基酸序列連接在腸牯膜微絨毛膜表面。前乳糖酶原由位于氨基末端的信號肽域、前導(dǎo)肽域、胞外域、疏水的跨膜錨定區(qū)、羧基末段的胞內(nèi)段組成，在信號肽引導(dǎo)下進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)過一系列修飾，乳糖酶原進(jìn)入高爾基體后被O-糖基化，然后經(jīng)歷細(xì)胞內(nèi)和腸腔的2次裂解后形成成熟的乳糖酶。

2.2 乳糖酶與基因克隆

1969年哈佛大學(xué)beekwith博士研究小組應(yīng)用DNA分子雜交技術(shù)首次分離得到大腸埃希菌乳糖酶基因，揭開了構(gòu)建乳糖酶基因庫的序幕，已經(jīng)有很多種來源的乳糖酶基因被克隆。Juajun O等［4］從芽胞桿菌DSM13中克隆出乳糖酶的基因，Rhimi M等［5］從乳酸桿菌屬的菌種中克隆出一種表達(dá)乳糖酶的基因，并且都在大腸埃希菌中進(jìn)行表達(dá)，重組酶的溫度和pH的適應(yīng)性范圍都更寬。王政等［6］利用PCR技術(shù)從保加利亞德氏乳桿菌中克隆出全長為3 024 bp的乳糖酶基因，并將此基因與不同來源的乳糖酶基因進(jìn)行同源性比較。

2.3 乳糖酶與基因多態(tài)性

自2002年Enattah提出根皮苷水解酶基因上游C/T-13910和G/A-22018變異型是LD的基因標(biāo)志物以來，關(guān)于這2個單核苷酸的研究很多。對數(shù)百個腸黏膜活檢的分析表明，基因型C/C-13910與乳糖酶活性(＜10 U/g蛋白)呈負(fù)相關(guān)，而基因型C/T-13910和T/T-13910與乳糖酶活性呈正相關(guān)。C/C-13190基因型在北俄羅斯種群中的比例是35.6%，其他C/T-13910基因附近和與乳糖酶活性有關(guān)的基因在調(diào)查中沒有發(fā)現(xiàn)，這些乳糖酶不持續(xù)表達(dá)的人群對牛奶的消耗比乳糖不耐受的群體低，但是不顯著［7］。在老年人群中調(diào)整乳制品攝入量，證明C/T-13910基因多態(tài)性還和肥胖相關(guān)［8］，對于單基因底物延展技術(shù)處理過的基因型為C/T-13910的病人，在攝入50 g乳糖之后進(jìn)行呼氣氫試驗(yàn)［9］，26%的病人是CC基因型積極反應(yīng)，74%是CC基因型消極反應(yīng)(其中48%是TC基因型，26%是TT基因型)基因頻率沒有變化，在CC基因型中，基因型和呼氣氫試驗(yàn)是相關(guān)聯(lián)的。

Oct-1、GATA、叉頭框和HNF-4α結(jié)合位點(diǎn)等構(gòu)成乳糖酶增強(qiáng)子，變異型C/T-13910位于增強(qiáng)子的中央，變異型T-13910轉(zhuǎn)錄活性是C-13910的3～6倍。在乳糖酶基因上游的基因G-13914也和乳糖酶基因活性增強(qiáng)有關(guān)［10］。Oct-1和HNF-4α結(jié)合位點(diǎn)在基因C/G-14010周圍，實(shí)驗(yàn)證明基因型C-14010比G-14010對Oct-1親和力更強(qiáng)［11］，3-磷酸甘油醛脫氫酶與Oct-1具有相互作用，可解釋二者共純化問題［12］。超遷移分析表明，Oct-1能直接同變異型T-13910結(jié)合，且強(qiáng)于Oct-1與變異型C-13910之間的結(jié)合［13］。變異型C-13910和T-13910均能增強(qiáng)乳糖酶啟動子的活性。對未分化的Caco-2細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，與包含C-13910的區(qū)域相比，包含T-13910的區(qū)域使乳糖酶啟動子的活性增加25%～75%［14］。

3 乳糖酶的應(yīng)用

3.1 在乳產(chǎn)品中的應(yīng)用

3.1.1 解決結(jié)晶問題由于乳糖結(jié)晶在濃縮乳制品或者冷凍制品中往往造成產(chǎn)品的(砂狀組織)缺陷，若在加工中添加20%～30%的乳糖水解酶，不但可以防止結(jié)晶現(xiàn)象發(fā)生，還可以增加產(chǎn)品的甜度，減少蔗糖用量。

3.1.2 發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用用乳糖水解乳制造酸乳，可以縮短乳凝固時間約15%～20%，且由于乳酸菌生長快，菌數(shù)多，能延長酸乳的貨架期，產(chǎn)品黏度也較大，若水解程度較大時，甜度也增加。因此，在制作水果酸乳時不僅可減少糖的用量，而且水果的風(fēng)味也會增強(qiáng);用乳糖水解乳加工干酪時，可縮短凝乳時間，并使凝塊堅(jiān)實(shí)，還可減少排除乳清時造成的損失，產(chǎn)量可增加10%。

3.1.3 作為替代添加劑乳清和超濾乳清中的乳糖部分水解可增加產(chǎn)品的甜味，提高糖的溶解度。不同比例的葡萄糖和半乳糖混合物的甜度相當(dāng)于蔗糖甜度的65%～80%，溶解度增加3～4倍，這種糖漿的總固形物含量達(dá)75%，可代替卵蛋白和蔗糖制作面包、餅干和蛋糕等，還可代替加糖濃縮牛乳制作牛乳軟糖等，且不會出現(xiàn)紋理、沙包、乳糖結(jié)晶和焦糖等現(xiàn)象。乳糖溶液經(jīng)乳糖酶水解形成半乳糖和葡萄糖的混合液，稱為半乳糖葡萄糖糖漿。其甜度與等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖相近。可代替蔗糖用于各種點(diǎn)心、飲料、罐頭食品及冰淇淋和雪糕的加工，效果很好。

“尉曰：‘今將軍尚不得夜行，何乃故也！’”原文用“曰”字，并沒有用表示霸陵尉態(tài)度的明顯詞語，而在英文翻譯中卻有“the watchman retorted”，“retorted”有反駁、回嘴之意，帶有抵抗意味。漢語原文中有很多都是直接“某某曰”，沒有表示人物情感態(tài)度的詞語，在英譯過程中加入表示情感態(tài)度變化的詞語，有助于讀者體會人物的心境。

3.1.4 低聚半乳糖的生產(chǎn)低聚半乳糖是以牛乳中的乳糖為原料，經(jīng)β-半乳糖苷酶催化水解半乳糖苷鍵，生成半乳糖和葡萄糖，并通過轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用，將水解下來的半乳糖苷轉(zhuǎn)移到乳糖分子生成的。低聚半乳糖具有較強(qiáng)的耐酸性、耐熱性，不會因?yàn)樵诩庸み^程中的高溫殺菌及人體胃酸所分解而失去其本來應(yīng)有的特性，而且能有效地被雙歧桿B菌和乳酸桿A菌同時利用，因此低聚半乳糖的生產(chǎn)和應(yīng)用也相當(dāng)廣泛［15］，特別是在日本，隨著人們越來越注重健康，低聚半乳糖將會有很大市場。

3.2 促進(jìn)果蔬成熟及軟化

軟化是果實(shí)成熟的重要標(biāo)志，是一個復(fù)雜而有序的過程，涉及一系列生理生化反應(yīng)。果實(shí)成熟過程中初生細(xì)胞壁在細(xì)胞壁多糖降解酶的作用下，細(xì)胞壁多糖發(fā)生降解，高聚物解離，細(xì)胞壁組織變軟導(dǎo)致果肉軟化。乳糖酶可以使細(xì)胞壁的組分變得不穩(wěn)定，并通過降解具支鏈的多聚醛酸使果膠降解或溶解，使果實(shí)軟化。莊軍平等［16］利用已報道的乳糖酶基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，從香蕉果實(shí)中得到900 bp左右的1個片段，該片段的氨基酸序列與蘆筍、草莓、番茄、芒果及鱷梨等果實(shí)相應(yīng)的基因相似性分別是85.5%、80.9%、80.5%、79.1%、76.3%。

闞娟等［17］采用氣相色譜法測定不同成熟時期桃果實(shí)的乙烯釋放量以及ACC合成酶和ACC氧化酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)乳糖酶不同于多聚半乳糖醛酸酶，其作用主要與桃果實(shí)成熟前期果實(shí)的軟化啟動密切相關(guān)。

3.3 乳糖酶作為檢測衰老細(xì)胞的標(biāo)志

1995年Dimri首次提出了一種可在體內(nèi)鑒別衰老細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志乳糖酶，報道中提出體內(nèi)或體外的衰老成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)此酶，而休眠細(xì)胞和終末分化細(xì)胞則缺乏，永生細(xì)胞中也無此酶的表達(dá)。因此此酶可以作為檢測衰老細(xì)胞的重要標(biāo)志。Kurz DJ等［18］基于一些間接生理實(shí)驗(yàn)得出衰老細(xì)胞溶酶體中的乳糖酶活性增加。陳俊香等［19］的研究結(jié)果表明隨增齡，大鼠腎組織乳糖酶表達(dá)逐漸增強(qiáng)。然而也有研究對此質(zhì)疑，Bo Yun Lee等［20］通過研究得出乳糖酶的活性之所以在衰老細(xì)胞中增加是通過溶酶體乳糖酶基因(GLB1)的編碼，而且在衰老細(xì)胞中溶酶體乳糖酶蛋白的表達(dá)也會增加，得出乳糖酶并不是衰老細(xì)胞的標(biāo)志。

3.4 在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

乳糖酶可作為助消化類藥物，適用于嬰兒各種消化不良癥，如原發(fā)性乳糖酶缺乏，因胃障礙及缺鐵所致的幼兒慢性腹瀉、幼兒及新生兒腹瀉等，且對新生兒無毒害作用。用于治療乳糖不耐受的乳糖酶藥物還可與其他抗生素聯(lián)用，與杜迪和思密達(dá)治療輪狀病毒腸炎能明顯有效地縮短病程，療效確切，治愈率高［21］。此類藥物可調(diào)整腸道正常菌群，拮抗輪狀病毒，對腸黏膜上皮細(xì)胞損傷有一定治療效果。很多藥物中都含有乳糖酶，如乳糖酶凍干酵母制劑、酵母乳糖酶腸溶微囊制劑等。

醫(yī)學(xué)上乳糖氫呼吸檢查(H(H(2)-BTs))被廣泛用于診斷乳糖酶缺陷，最常見的是乳糖不耐受癥狀的診斷，Oberacher M等［22］通過3個呼吸實(shí)驗(yàn)說明這個呼吸測試對乳糖酶缺陷具有良好的敏感性和特異性，呼吸實(shí)驗(yàn)可以簡化但時間無法縮短。研究發(fā)現(xiàn)對乳糖的分解能力也可作為一些疾病發(fā)生風(fēng)險的標(biāo)志［23］，實(shí)驗(yàn)測試者對乳制品食物消化后，雙歧桿菌和大便乳酸菌的檢測表明某些疾病的發(fā)生風(fēng)險和乳制品食物的攝入有關(guān)。對于乳糖不耐受的治療，用乳酸桿菌和半乳糖苷酶治療乳糖不耐癥的病人，通過氫呼吸實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，乳酸桿菌和半乳糖苷酶都強(qiáng)烈提高胃腸道對乳糖的攝入吸收。由此可知益生菌對于乳糖不耐受治療持續(xù)性較好［24］。

3.5 乳糖酶基因在基因工程中的應(yīng)用

3.5.1 在載體構(gòu)建中的應(yīng)用乳糖酶基因編碼的產(chǎn)物水解底物X-gal，可呈現(xiàn)藍(lán)色，易于檢測和觀察，在構(gòu)建表達(dá)載體LacZ基因置于啟動子下游，通過藍(lán)白斑來篩選陽性重組載體。

3.5.2 作為報告基因的應(yīng)用乳糖酶是一種常用的報告基因分子，經(jīng)常與熒光素酶報告基因一起轉(zhuǎn)染細(xì)胞，被用作熒光素酶報告基因檢測的內(nèi)參照，從而消除因?yàn)橘|(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率不同而帶來的誤差。汪國忠等［25］以β-galactosidase質(zhì)粒為報告基因，將其與自制氟碳?xì)怏w微泡黏附，制備載基因微泡。利用診斷性超聲破裂微泡進(jìn)行體外心肌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染，采用原位染色及酶學(xué)定量檢測βgalactosidase表達(dá)水平，同時進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。

其作為報告基因還用于研究啟動子的效能和啟動子不同位點(diǎn)突變對表達(dá)效能的影響。陳曉月等［26］為檢測構(gòu)建的枯草芽胞桿菌分泌表達(dá)載體

pGPST中啟動子和信號肽的活性，將β-半乳糖苷酶基因插入表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建含有β-半乳糖苷酶基因的重組質(zhì)粒pGPST-lacZ。

3.5.3 構(gòu)建產(chǎn)乳糖酶基因工程菌利用基因工程技術(shù)，可以將活性高的乳糖酶基因?qū)胍子谂囵B(yǎng)、生產(chǎn)繁殖迅速的微生物體內(nèi)，從而降低乳糖酶生產(chǎn)成本。Domingues等［27］利用絮狀釀酒酵母和黑曲霉中含有編碼分泌胞外乳糖酶的LacA基因構(gòu)建重組菌株，使重組釀酒酵母菌株能夠分泌可高效利用乳糖的乳糖酶。Ibrahim等［28］使用化學(xué)誘變劑對2株雙歧桿菌、乳植桿菌和嗜熱鏈球菌進(jìn)行誘變，篩選高產(chǎn)菌株，長雙歧的誘變菌株產(chǎn)酶量比野生型增加2倍多。為了獲得高產(chǎn)菌株，新基因工程菌不斷出現(xiàn)。生產(chǎn)酶的工程菌以大腸埃希菌、酵母菌為主，還有嗜熱鏈球菌、乳桿菌等［29］。

4 低溫乳糖酶的研究

由于低溫乳糖酶有其本身的優(yōu)越性，近年來已成為研究的熱點(diǎn)，很多科學(xué)家都開始研究南極等那些常年冰封的土壤或者湖中的微生物［30-32］，已報道低溫乳糖酶產(chǎn)生菌有嗜冷菌和耐冷菌，通過16S rRNA序列分析可知，大多數(shù)低溫乳糖酶產(chǎn)生菌為節(jié)桿菌(Arthrobacter)和交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)［33］。

在我國，周春雷等［34］從北冰洋楚科奇海、加拿大海盆、格陵蘭海和中國南極中山站近岸的海水、海冰和沉淀物樣品中分離出322株低溫細(xì)菌中篩選出73株低溫乳糖酶產(chǎn)生菌，通過研究其產(chǎn)生的乳糖酶具有較好的適應(yīng)低溫特性。馬宏偉等［35］從內(nèi)蒙古寶格達(dá)山高山凍土以及乳制品中分離到25株嗜冷菌，利用產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶模型篩選，獲得1株低溫酶高產(chǎn)菌株。史應(yīng)武等［36］從新疆高寒凍土、冷凍乳制品及生乳中分離到101株耐冷菌，利用低溫β-半乳糖苷酶篩選模型，獲得1株低溫酶高產(chǎn)菌株，并且對菌特性和酶特性進(jìn)行了研究。

1株新的具有低溫乳糖酶活性的菌株從北極的土壤中被分離出來，對應(yīng)的基因被克隆并且在大腸埃希菌中表達(dá)，分析DNA序列得知其屬于糖基化水解酶家族2［37］。Bia?kowska AM等［38］從南極土壤中分離出的節(jié)桿菌屬的菌20B，其本身是低溫菌，且產(chǎn)的乳糖酶也是低溫酶，Wang K等［39］從土壤基因組文庫中分離出一種新的β-半乳糖基因ZD410，分析結(jié)果表示，該序列編碼的蛋白由672個氨基酸組成，其分子量為78.6 ku，由于此基因表達(dá)的β-半乳糖苷酶在低溫條件下有較高活性，把此種酶認(rèn)定為一種低溫酶。James A等［40］發(fā)現(xiàn)微小的結(jié)構(gòu)基因的改變都會影響乳糖酶的熱穩(wěn)定性，bgaS3基因有在低溫環(huán)境下恢復(fù)蛋白活性的作用，BgaS26和BgaS7基因改變的酶和含有BgaS基因的酶有相似的最適溫度和熱穩(wěn)定性。BgaS7提高了酶在15℃的活性，而且在2.5℃水解80%的乳糖酶所用的時間是BgaS的一半。

5 結(jié)論

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人們對乳糖酶的進(jìn)一步研究，乳糖酶的應(yīng)用范圍越來越廣，將來乳糖酶的應(yīng)用就不僅僅局限于解決乳糖不耐受問題，還將在食品、醫(yī)藥、環(huán)保、基因治療等各個領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，具有廣闊的市場前景。

由于近年來低溫乳糖酶的研究成為熱點(diǎn)，乳糖酶的生產(chǎn)成本也將大幅降低，乳糖酶的適應(yīng)性也將提高。目前，本實(shí)驗(yàn)室也正在從我國寒冷地區(qū)的土樣中對低溫乳糖酶產(chǎn)生菌株進(jìn)行篩選并且將克隆其基因到大腸埃希菌中表達(dá)，隨著研究的深入，低溫乳糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)及其在各個方面的應(yīng)用將會逐步實(shí)現(xiàn)。

［1］ P.Nicholas.Beta-Galactosidase Activity in psychrotrophic Mictroorganisms and their Potential use in Food Industry［J］.Czech Food Sci，2002，20(2):43-47.

［2］ 王輝.低乳糖牛奶生產(chǎn)工藝參數(shù)的研究［J］.中國乳品工業(yè)，2006，34(1):52-53.

［3］ 祁艷霞.熱穩(wěn)定性β-半乳糖苷酶工程菌構(gòu)建及其培養(yǎng)條件優(yōu)化［D］.西安:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2005.

［4］ Juajun O，Nguyen TH，Maischberger T，et al.Cloning，purification，and characterization of β-galactosidase from Bacillus licheniformis DSM 13［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2011，89(3):645-654.

［5］ Rhimi M，Aghajari N，Jaouadi B，Juy M，et al.Exploring the acidotolerance of beta-galactosidase from Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus:an attractive enzyme for lactose bioconversion［J］.Res Microbiol，2009，160(10):775-784.

［6］ 王政，馬文麗，鄭文嶺.乳糖酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，15(2):104-106.

［7］ Khabarova YA，Torniainen ST，Nurmi HA，et al.Prevalence of lactase persistent/non-persistent genotypes and milk consumption in a young population in north-west Russia［J］.World J Gastroenterol，2009，15(15):1849-1853.

［8］ Corella D，Arregui M，Coltell O，et al.Association of the LCT-13910C＞T Polymorphism With Obesity and Its Modulation by Dairy Products in a Mediterranean Population［J］.Obesity(Silver Spring)，2010，30.

［9］ Krawczyk M，Wolska M，Schwartz S，et al.Concordance of genetic and breath tests for lactose intolerance in a tertiary referral centre［J］.J Gastrointestin Liver Dis，2008，17(2):135-139.

［10］ Khabarova Y，Torniainen S，Savilahti E，et al.The-13914G＞A variant upstream of the lactase gene(LCT)is associated with lactase persistence/non-persistence［J］.Scand J Clin Lab Invest，2010，70(5):354-357.

［11］ Jensen TG，Liebert A，Lewinsky R，et al.The-14010*C variant associated with lactase persistence is located between an Oct-1 and HNF1α binding site and increases lactase promoter activity［J］.Hum Genet，2011，15.

［12］ Zheng L，Roeder RG，Luo YS.Phase activation of the histone H2B promoter by OCA-S，a coactivator complex that contains GAPDH as a key component［J］.Cell，2003，114(2):255-266.

［13］ Lewinsky RH，Moller J，Stensballe A，et al.T-13910 DNA variant associated with lactase persistence interacts with Oct-1 and stimulates lactase promoter activity in vitro［J］.Hum Mol Genet，2005，14(24):3945-3953.

［14］ Olds LC，Sibley E.Lactase persistence DNA variant enhances lactase promoter activity in vitro:functional role as a cis regulatory elemen［J］.Hum Mol Genel，2003，12(18):2333-2340.

［15］ Ah-Reum Park，Deok-Kun Oh.Galacto-oligosaccharide production using microbial β-galactosidase:current state and perspectives［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，85(5):1279-1286.

［16］ 莊軍平，蘇菁，陳維信.香蕉果實(shí)β-半乳糖苷酶基因cDNA克隆及序列分析［J］.西北植物學(xué)報，2006，26(1):18-22.

［17］ 闞娟，金昌海，汪志君，等.β-半乳糖苷酶及多聚半乳糖醛酸酶對桃果實(shí)成熟軟化的影響［J］.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，2006，27(3):76-80.

［18］ Kurz DJ，Decary S，Hong Y，Erusalimski JD.Senescence-associated β-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells［J］.J.Cell Sci，2000，113(Pt20):3613-3622.

［19］ 陳俊香，卓莉，馬強(qiáng)，等.衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶在老年大鼠腎臟組織中的變化及意義［J］.醫(yī)學(xué)臨床研究，2009，26(11):2022-2025.

［20］ Bo Yun Lee，Jung A.Han，Jun Sub Im，et al.Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal-galactosidase［J］.Aging Cell，2006，5(2):187-195.

［21］ 張松成.杜迪、思密達(dá)、大劑量乳酶生治療輪狀病毒腸炎［J］.醫(yī)藥論壇雜志，2004，5(2):23-26.

［22］ Oberacher M，Pohl D，Vavricka SR，et al.Diagnosing lactase deficiency in three breaths［J］.Eur J Clin Nutr，2011，65(19):614-618.

［23］ Szilagyi A，Shrier I，Heilpern D，et al.Differential impact of lactose/lactase phenotype on colonic microflora［J］.Can J Gastroenterol，2010，24(6):373-379.

［24］ Ojetti V，Gigante G，Gabrielli M，et al.The effect of oral supplementation with Lactobacillus reuteri or tilactase in lactose intolerant patients:randomized trial［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2010，14(3):163-170.

［25］ 汪國忠，胡申江，鄭哲嵐，等.超聲破裂載基因微泡增強(qiáng)心肌細(xì)胞報告基因的轉(zhuǎn)染與表達(dá)［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2005，21(4):371-375.

［26］ 陳曉月，金寧一，鄒偉，等.β-半乳糖苷酶在枯草芽胞桿菌中的分泌表達(dá)［J］.中國生物工程雜志，2008，28(5):111-115.

［27］ Domingues L，Onnela M-L，Teixeira JA，et al.Construction of a flocculent brewer’s yeast strain secreting Aspergillus niger βgalactosidase［J］.Appl Microbial Biotechnol，2000，54(1):97-103.

［28］ Ibrahim S A，Osulluvan D J.Use of chemical mutagenesis for the isolation of food grade β-galactosidase overproducing mutants of bifidobacteria，lactobacilli and Streptococcus salivarius ssp.thermophilus［J］.J.Dairy Sci，2000，83(5):923-930.

［29］ 呂曉華，劉世貴，高榮.生物技術(shù)在乳糖不耐受防治中的應(yīng)用［J］.中國乳品工業(yè)，2002，30(1):44-47.

［30］ Kate M.Clocksin，Deborah O.Jung，and Michael T.Madigan.Cold-Active Chemoorganotrophic Bacteria from Perma-nently Ice-Covered Lake Hoare，McMurdo Dry Valleys，Antarctica［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，9(73):3077-3083.

［31］ Lindsay J.Mondino，Marie Asao，Michael T.Madigan.Coldactive halophilic bacteria from the ice-sealed Lake Vida，Antarctica［J］.Arch Microbiol，2009，191(10):785-790.

［32］ U.Stingl，J.-C.Cho，W.Foo，et al.Dilution-to-Extinction Culturing of Psychrotolerant Planktonic Bacteria from Permanently Ice-covered Lakes in the McMurdo Dry Valleys，Antarctica［J］.Microb Ecol，2008，55(3):395-405.

［33］ 劉文玉，史應(yīng)武，王杏芹.低溫β-半乳糖苷酶的研究進(jìn)展［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，44(5):647-651.

［34］ 周春雷，俞勇，李會榮，等.低溫β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定、生長特性及酶學(xué)性質(zhì)的初步研究［J］.極地研究，2010，22(1):48-55.

［35］ 馬宏偉，王聰，胡立新.低溫β-半乳糖苷酶菌株的篩選［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31(4):136-138.

［36］ 史應(yīng)武，婁愷，?，|，等.產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶菌株的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)的研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(11):350-352.

［37］ Schmidt M，Stougaard P.Identification，cloning and expression of a cold-active beta-galactosidase from a novel Arctic bacterium，Alkalilactibacillus ikkense［J］.Environ Technol，2010，31(10):1107-1114.

［38］ Bia?kowska AM，Cie?liński H，Nowakowska KM，et al.A new beta-galactosidase with a low temperature optimum isolated from the Antarctic Arthrobacter sp.20B:gene cloning，purification and characterization［J］.Arch Microbiol，2009，191(11):825-835.

［39］ Wang K，Li G，Yu SQ，Zhang CT，et al.A novel metagenomederived beta-galactosidase:gene cloning，overexpression，purification and characterization［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，88(1):155-165.

［40］ James A，Coker J E.Brenchley.Protein engineering of a cold-active β-galactosidase from Arthrobacter sp.SB to increase lactose hydrolysis reveals new sites affecting low temperature activity［J］.Extermophiles，2006，10:515-524.