林飛燕，陸春*，葉庭路

(1.中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院皮膚病與性病科，廣東廣州510630;2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚病與性病科，廣東深圳518036)

解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum，Uu)為泌尿生殖道常見微生物，與許多泌尿生殖道疾病如非淋球菌尿道炎相關(guān)，也是男性不育、女性不孕及不良妊娠的常見病因之一。近年來隨著支原體耐藥情況、慢性持續(xù)性難治性感染的現(xiàn)象愈演愈烈，支原體感染的臨床治療效果面臨挑戰(zhàn)，關(guān)于Uu耐藥機(jī)制的探討已成為Uu研究的一大熱點(diǎn)。生物膜(Biofilm，BF)是微生物繁殖過程中將菌體包裹在自身產(chǎn)生的多糖、蛋白質(zhì)和DNA等胞外基質(zhì)中形成的團(tuán)塊結(jié)構(gòu)，多項(xiàng)研究表明生物膜的形成可以增強(qiáng)微生物對(duì)環(huán)境和抗生素的耐受性，目前生物膜的形成已被列入細(xì)菌耐藥尤其多重耐藥的機(jī)制之一［1］。國(guó)外已有研究證實(shí)Uu可以形成生物被膜，并且生物膜形成可同時(shí)增強(qiáng)Uu對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、四環(huán)素等多種常用抗菌素的抵抗力［2］。對(duì)Uu生物膜的形成、耐藥性和耐藥機(jī)制的研究，為Uu臨床感染和抗生素耐藥機(jī)制提供了新的探索方向。既往Uu 的體外藥敏主要是針對(duì)游離菌株進(jìn)行，并不能真實(shí)反映Uu體內(nèi)生物膜形成和耐藥情況，因此，Uu生物膜的培養(yǎng)及藥敏檢測(cè)技術(shù)將繼游離支原體藥敏試驗(yàn)之后，成為探討Uu耐藥水平與耐藥機(jī)制的又一重要手段。然而由于支原體生長(zhǎng)的生物學(xué)特性，使培養(yǎng)基pH發(fā)生改變，而偏堿性環(huán)境下Uu會(huì)迅速死亡的生物學(xué)特性，使實(shí)驗(yàn)中需要多次更換培養(yǎng)基并使菌液直接暴露，增加了污染的概率，培養(yǎng)過程中的雜菌污染由此成為決定Uu生物膜實(shí)驗(yàn)成功與否的一大問題。本文將對(duì)解脲脲原體生物膜的培養(yǎng)與藥敏檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行介紹，列舉可疑污染的表現(xiàn)及分析思路，并對(duì)實(shí)驗(yàn)操作過程中常見的污染途徑與相應(yīng)的質(zhì)控策略進(jìn)行探討，希望能對(duì)今后國(guó)內(nèi)生物膜相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究起到借鑒作用。

1 Uu生物膜的培養(yǎng)與藥敏的方法

最小生物膜抑制濃度(Minimal Biofilm Inhibitory Concentration，MBIC)定義為陽性對(duì)照的微生物固定菌落剛開始使培養(yǎng)基變色時(shí)，某抗菌藥物能抑制其實(shí)驗(yàn)菌培養(yǎng)基變色的最低濃度［2］。參考近幾年國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)［2-3］，目前Uu生物被膜培養(yǎng)以及藥敏試驗(yàn)均以尿素肉湯液體培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)載體，一般在CO2溫箱37℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行藥敏檢測(cè)，具體方法如下:在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入U(xiǎn)u液體培養(yǎng)基180 μL/孔，再加入U(xiǎn)u菌液(CCU為104～105/mL)20 μL/孔，每24 h換液1次，48 h后棄去培養(yǎng)基，用滅菌PBS緩沖液200 μL/孔沖洗3次，棄去PBS緩沖液，再逐孔加入含不同濃度梯度的抗生素培養(yǎng)基200 μL/孔，滴加石蠟油1～2滴/孔，觀察48 h直至陽性不加藥對(duì)照孔培養(yǎng)基變紅色時(shí)記錄生物被膜的最低抑菌濃度即MBIC。

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，在保證培養(yǎng)基pH為6.0、菌液濃度單位為104～105/mL的實(shí)驗(yàn)條件下，液體培養(yǎng)基多在第24 h前后開始變?yōu)榧t色即提示Uu菌株生長(zhǎng)，而在更換培養(yǎng)基之后，常未足48 h培養(yǎng)基即已變?yōu)樯罴t色。此后若在第48 h再予以更換培養(yǎng)基，則會(huì)出現(xiàn)支原體無生長(zhǎng)(培養(yǎng)基不再變?yōu)榧t色)或生長(zhǎng)受抑制(培養(yǎng)基變紅時(shí)間明顯延遲)?？赡苁怯捎赨u的生長(zhǎng)分為遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定器和遲緩期，在恢復(fù)生長(zhǎng)之后首先是緩慢增殖，經(jīng)歷遲緩期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期而開始迅速增殖［4］。在環(huán)境穩(wěn)定、營(yíng)養(yǎng)充足的情況下，Uu后24 h的生長(zhǎng)速度必然會(huì)快于前24 h，因而在48 h之前就會(huì)出現(xiàn)Uu過渡生長(zhǎng)、大量分解尿素產(chǎn)氨堿化培養(yǎng)基，從而在過堿性的環(huán)境中迅速死亡或抑制生長(zhǎng)。經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果在第36 h時(shí)更換培養(yǎng)基，則不會(huì)出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)抑制的情況，同時(shí)可以維持Uu生長(zhǎng)環(huán)境的穩(wěn)定以及提供充足的營(yíng)養(yǎng)，有利于Uu正常增殖。但是，更換培養(yǎng)基的次數(shù)增多無疑又增加了實(shí)驗(yàn)污染的風(fēng)險(xiǎn)。

2 Uu培養(yǎng)中的常見污染及分析

臨床中判斷Uu的生長(zhǎng)狀況主要根據(jù)肉眼觀察培養(yǎng)基的顏色變化，其原理是根據(jù)Uu分解培養(yǎng)基中的尿素產(chǎn)堿使pH上升，而酚紅指示劑在由酸變堿時(shí)顏色會(huì)由黃變紅，如果培養(yǎng)基變?yōu)榧t色且液體澄清判讀為Uu陽性，不變色且澄清則為陰性無污染。但是能分解尿素的微生物很多，已知脲酶陽性的有部分金黃色葡萄球菌及腸桿菌、表皮葡萄球菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、新型隱球菌等等，這些雜菌的生長(zhǎng)不僅會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)基渾濁，也會(huì)使培養(yǎng)基變紅，從而影響對(duì)Uu生長(zhǎng)的正確判斷。

各種污染可能情況分析如下:①如果培養(yǎng)基不變紅色而出現(xiàn)渾濁，常為不產(chǎn)脲酶的污染菌所污染且Uu為陰性，但是需注意由于有細(xì)菌生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)，會(huì)消耗培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)成分，不排除不產(chǎn)脲酶細(xì)菌的濃度過高而抑制支原體生長(zhǎng)出現(xiàn)假陰性;②理論上講，只要待檢標(biāo)本中存在的脲酶陽性細(xì)菌，都有可能使培養(yǎng)基變紅，但其結(jié)果還與細(xì)菌濃度有關(guān)。低濃度細(xì)菌(102～103/mL)的Uu培養(yǎng)管中液體仍清亮，呈黃色，無明顯混濁，高濃度細(xì)菌(104～105/mL)的Uu培養(yǎng)管中液體呈紅色，不同程度混濁［5］。同時(shí)出現(xiàn)紅色與渾濁的培養(yǎng)基中，既可能為Uu陽性合并污染，也可能為產(chǎn)脲酶菌污染以及伴或不伴Uu生長(zhǎng)，臨床檢驗(yàn)一般會(huì)判斷陰性，但如果其中同時(shí)有Uu生長(zhǎng)就會(huì)造成假陰性的判斷［6］;③某些細(xì)菌在使Uu培養(yǎng)基變紅的同時(shí)，培養(yǎng)基會(huì)出現(xiàn)異臭味，如變形桿菌、銅綠假單胞菌等則可直接排除［5］;④對(duì)于以上各種可疑的污染，實(shí)驗(yàn)中通常將污染結(jié)果剔除，也因此會(huì)由于重復(fù)操作而增加了實(shí)驗(yàn)成本。但有些污染的標(biāo)本外觀和Uu真陽性無法區(qū)別，這更值得注意，這種情況下需要增加質(zhì)控項(xiàng)目，除應(yīng)用孔徑為0.45 μm的無菌濾膜過濾并進(jìn)行Uu鑒別固體培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定外，還應(yīng)在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)菌液與培養(yǎng)基隨機(jī)取樣，進(jìn)行細(xì)菌分離及脲酶實(shí)驗(yàn)，出現(xiàn)分解尿素的細(xì)菌即判為污染。

總體而言，支原體培養(yǎng)基中污染菌的種類繁多、尚無簡(jiǎn)便易行的分離與鑒定方法，另外實(shí)驗(yàn)過程中各種污染途徑尚具有偶然性與不可預(yù)測(cè)性，故多數(shù)不以污染菌為研究目的的支原體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，例如支原體生物膜的培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)，通常沒有足夠的條件、亦不可能對(duì)所有可疑的污染菌進(jìn)行分離與鑒定。因此，監(jiān)控實(shí)驗(yàn)污染最直接而有效的策略是規(guī)范無菌操作、嚴(yán)格控制高污染風(fēng)險(xiǎn)的操作環(huán)節(jié)、細(xì)致觀察培養(yǎng)基、徹底剔除被污染的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 Uu生物膜培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)中的污染途徑及解決策略

由于支原體生長(zhǎng)的生物學(xué)特性，使培養(yǎng)基pH發(fā)生改變，而偏堿性環(huán)境下Uu會(huì)迅速死亡的生物學(xué)特性，使實(shí)驗(yàn)中需要多次更換培養(yǎng)基并使菌液直接暴露，增加了污染的概率，培養(yǎng)過程中的雜菌污染由此成為決定Uu生物膜實(shí)驗(yàn)成功與否的一大關(guān)鍵問題。下文列舉了實(shí)際操作過程中常見的污染途徑與相應(yīng)的質(zhì)控策略，希望能對(duì)今后國(guó)內(nèi)生物膜相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究起到借鑒作用。

3.1 Uu菌液的準(zhǔn)備與保存

3.1.1 菌液準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所用的臨床支原體菌株必須經(jīng)過嚴(yán)格的培養(yǎng)、分離、鑒定過程:經(jīng)微孔濾器過濾預(yù)處理雜菌，肉湯增菌觀察顏色變化，將變紅的增菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)瓊脂固體培養(yǎng)基，觀察其典型菌落形成，依據(jù)菌落形態(tài)和有關(guān)生化、分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定，挑取單個(gè)的典型菌落轉(zhuǎn)種至液體培養(yǎng)基，-72℃超低溫冰箱冷凍保存［4］。

3.1.2 菌液存取即使擁有合格無污染的待測(cè)菌液，在菌液轉(zhuǎn)移保存、菌液濃度測(cè)定、稀釋菌液至實(shí)驗(yàn)濃度等環(huán)節(jié)中，也可能由于無菌操作的失誤導(dǎo)致污染。例如，通常用1.5 mL EP管保存菌液，由于水凝固后體積增加，如保存菌液量過大(大于1.3 mL/管)則結(jié)冰后易膨脹甚至頂開EP管蓋而導(dǎo)致污染，此時(shí)應(yīng)將受污染的菌液棄去，再次取材重復(fù)操作。此外，實(shí)驗(yàn)早期就應(yīng)做好純化菌株的備份，并嚴(yán)格保證凍存菌液無污染，以及避免對(duì)備份菌液重復(fù)打開操作，以減少污染后的反復(fù)分離、鑒定。

3.2 Uu肉湯液體培養(yǎng)基及抗生素-培養(yǎng)基

3.2.1 培養(yǎng)基的配制各種原料應(yīng)無菌處理后方可加入培養(yǎng)基，水質(zhì)選擇消毒無菌的雙蒸水或超純水，實(shí)驗(yàn)器材經(jīng)泡酸及高溫高壓消毒，培養(yǎng)基配制完成后及使用過程中，應(yīng)不定期取樣置于溫箱行無菌培養(yǎng)以排除污染。

3.2.2 培養(yǎng)基抑菌劑的選擇目前Uu培養(yǎng)基一般添加的抗菌劑為青霉素類，青霉素類對(duì)大多數(shù)革蘭陽性球菌的作用較強(qiáng)，但對(duì)陰性桿菌(常見變形桿菌)、真菌(常見白色念珠菌)無抑制作用，由此存在此類雜菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。關(guān)于Uu培養(yǎng)基中抑陰性桿菌抗菌劑的選擇，有研究［7］指出亞胺培南和哌拉西林/他唑巴坦對(duì)支原體無抑制作用，可用于抑制肉湯培養(yǎng)基中的陰性桿菌。氟康唑可以抑制常見的真菌污染如白色念珠菌，也不會(huì)抑制Uu生長(zhǎng)，同時(shí)各種理化性質(zhì)較穩(wěn)定以及MIC較低，賈亞利等［8］研究認(rèn)為31.25 μg/mL的氟康唑可以作為Uu培養(yǎng)基中真菌抑菌劑的首選。

3.2.3 更換培養(yǎng)基的操作①瓶裝培養(yǎng)基:必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼，傾倒培養(yǎng)基時(shí)瓶口應(yīng)凌空倒出，不宜直接接觸吸槽或其他瓶口等，倒出后應(yīng)再轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼瓶口與瓶蓋再蓋上;②移液槍:使用多道移液槍添加或更換培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)基常置于吸槽，會(huì)直接暴露于空氣中，易被空氣懸浮顆粒污染，故吸槽應(yīng)置于酒精燈旁的清潔區(qū)，同時(shí)操作動(dòng)作要輕柔，尤其在打出移液槍中的棄液時(shí)，廢液缸應(yīng)遠(yuǎn)離吸槽，移液槍槍口不宜對(duì)著吸槽方向。另外，一般8孔移液槍相配套的200 μL槍頭，在反復(fù)吸取培養(yǎng)基時(shí)，會(huì)在槍頭內(nèi)液體頂端出現(xiàn)氣泡，并直接接觸到移液槍受到污染，建議將每次的取液量減少1/2，即200 μL/孔的培養(yǎng)基量，改用100 μL/次的添加量操作2次，這樣可以減少來自移液槍的污染。

3.2.4 設(shè)定陰性對(duì)照孔每次添加或更換培養(yǎng)基時(shí)，必須設(shè)立培養(yǎng)基的陰性對(duì)照孔，即只在孔中加入200 μL/孔的培養(yǎng)基及滴加石蠟油。同時(shí)需注意，由于可能在操作過程中造成污染，故每次添加培養(yǎng)基需設(shè)定2個(gè)空白孔，其一是操作前的培養(yǎng)基，其二是操作后的培養(yǎng)基，這樣如果2孔均被污染提示吸槽或槍頭消毒不徹底，或瓶裝培養(yǎng)基污染，這時(shí)需再次檢測(cè)培養(yǎng)基，以及消毒吸槽與槍頭;如果僅第2孔出現(xiàn)污染，則提示培養(yǎng)基等無污染，污染來自操作過程，故應(yīng)重復(fù)該次操作。

3.2.5 抗生素-培養(yǎng)基稱取抗生素藥粉，溶解稀釋后應(yīng)經(jīng)微孔濾器預(yù)處理再用培養(yǎng)基稀釋。稀釋至目標(biāo)濃度后，每個(gè)濃度的抗生素-培養(yǎng)基均需行無菌培養(yǎng)排除污染后方可使用，每一批操作向96孔板加入抗生素后，均應(yīng)重復(fù)抗生素-培養(yǎng)基的無菌檢測(cè)，如有污染則重新稀釋配置。

3.3 操作環(huán)境與實(shí)驗(yàn)器材

3.3.1 生物安全柜的使用遵守生物安全柜操作說明，實(shí)驗(yàn)前清臺(tái)面及內(nèi)壁，紫外線照射30 min，將實(shí)驗(yàn)用器具外表面用75%乙醇噴淋或擦拭后放入生物安全柜，將循環(huán)過濾系統(tǒng)開啟后方可開始實(shí)驗(yàn)操作。實(shí)驗(yàn)后應(yīng)清潔臺(tái)面及內(nèi)壁，關(guān)閉循環(huán)過濾系統(tǒng)，紫外線照射30 min后方可關(guān)閉生物安全柜電源。超凈工作臺(tái)不合理的放置、不恰當(dāng)?shù)木S護(hù)以及不規(guī)范的使用會(huì)破壞超凈工作臺(tái)氣流的方向，導(dǎo)致飛沫更廣泛的沉積。酒精燈的火焰、操作者的活動(dòng)、談話、咳嗽及打噴嚏都有可能影響氣流。飛沫的沉積是導(dǎo)致超凈工作臺(tái)內(nèi)物品污染的主要因素，造成潛在污染的進(jìn)一步傳播［9］。

3.3.2 實(shí)驗(yàn)器材玻璃制品實(shí)驗(yàn)器材應(yīng)洗刷干凈，在濃酸溶液中浸泡過夜后反復(fù)清水沖洗，徹底去除酸液，合理包裝并高溫高壓消毒30 min及烘干后方可使用。實(shí)驗(yàn)器材為一次性塑料制品如96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，應(yīng)購(gòu)買合格、無菌、獨(dú)立包裝的產(chǎn)品，使用前檢查產(chǎn)品包裝密封性。EP管、槍頭等一次性塑料用品，以及塑料吸槽等，應(yīng)該用相應(yīng)盒子包裝、高溫高壓消毒30 min后方可使用，并且不宜多次實(shí)驗(yàn)反復(fù)使用，以更換培養(yǎng)基為例，每批更換后都應(yīng)將此類器材重復(fù)清潔消毒。

3.4 石蠟油

3.4.1 石蠟油污染石蠟油會(huì)直接造成污染導(dǎo)致前功盡棄，應(yīng)使用滅菌的石蠟油。

3.4.2 滴加石蠟油在往藥敏板接種滴加石蠟油時(shí)，原先正放的石蠟油瓶會(huì)因倒置會(huì)混有空氣，使下注后含有小氣泡，當(dāng)張力造成氣泡破裂后，不能全部復(fù)蓋住其下的接種液面，使培養(yǎng)基暴露而導(dǎo)致污染。同時(shí)，氣泡破裂后，還會(huì)因?yàn)閁u生長(zhǎng)產(chǎn)生的氨揮發(fā)而使pH值下降，藥敏孔由紅色再次變?yōu)辄S色，出現(xiàn)假陰性結(jié)果或高-低藥物濃度孔結(jié)果倒置。解決方法是在混有小氣泡的孔中再補(bǔ)加1滴石蠟油，確保藥敏孔被完全覆蓋［10］。

4 展望

綜上所述，生物膜體外藥敏試驗(yàn)方法的建立和穩(wěn)定性的探索，為Uu耐藥機(jī)制的探討提供了新的有力手段。隨著生物膜培養(yǎng)和藥敏方法的推廣，樣本量和實(shí)驗(yàn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的污染概率也會(huì)隨之增高。生物膜體外培養(yǎng)過程中存在多種潛在的污染途徑，因而對(duì)雜菌污染的有效預(yù)防和監(jiān)控，是Uu生物膜實(shí)驗(yàn)中必須要解決的一個(gè)重要問題。提高對(duì)Uu生物膜培養(yǎng)和藥敏檢測(cè)各環(huán)節(jié)中污染途徑的重視，進(jìn)行細(xì)節(jié)上的嚴(yán)格控制和改進(jìn)，降低雜菌污染對(duì)生物膜實(shí)驗(yàn)的干擾和危害，對(duì)生物膜的研究具有重要的意義。

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