王輝，楊崇廣，牛辰

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

細(xì)菌耐藥(drug resistance)是一個(gè)復(fù)雜的現(xiàn)象，涉及細(xì)菌本身、環(huán)境與宿主這幾個(gè)既相互獨(dú)立又相互作用的因素[1]。目前廣泛認(rèn)同的細(xì)菌耐藥機(jī)制主要有以下幾種：阻止藥物進(jìn)入微生物機(jī)體[2,3]；阻止藥物與其靶點(diǎn)結(jié)合[4,5]；微生物機(jī)體產(chǎn)生鈍化酶，使藥物失活或修飾改變[4,5]；改變藥物作用的靶點(diǎn)[4,5]。

在微生物研究領(lǐng)域中，通常以游離狀態(tài)下的單個(gè)細(xì)菌為對(duì)象，研究各種生理現(xiàn)象及機(jī)制，包括細(xì)菌耐藥性及其機(jī)制。近年來，微生物學(xué)家越來越關(guān)注細(xì)菌作為一個(gè)群體所表現(xiàn)出來的有別于其游離狀態(tài)的行為[6]。其中，細(xì)菌的群體性行為與耐藥性的關(guān)系是近年來的研究熱點(diǎn)。一般認(rèn)為，生物膜(biofilm)、群體感應(yīng)(quorum sensing)和程序性死亡(programmed cell death，PCD)是細(xì)菌群體性行為中的3個(gè)重要內(nèi)容。但是，群體感應(yīng)往往是細(xì)菌通過調(diào)控一些耐藥相關(guān)基因的表達(dá)或其他影響細(xì)菌耐藥的機(jī)制與耐藥性相關(guān)[7]，并非是細(xì)菌自身的直接作用。因此，本文就細(xì)菌生物膜和程序性死亡與耐藥性的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 細(xì)菌的生物膜與耐藥

生物膜是指細(xì)菌不可逆地黏附于物體表面及細(xì)菌間相互黏附，并被其自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)所包裹形成的結(jié)構(gòu)[8]。生物膜是細(xì)菌在自然界存在的一種普遍狀態(tài)。在感染過程中，與游離態(tài)細(xì)菌相比，形成生物膜的細(xì)菌生長較緩慢且基因表達(dá)發(fā)生改變。生物膜的形成提高了細(xì)菌抵抗宿主機(jī)體免疫系統(tǒng)和抗生素的能力，成為不斷產(chǎn)生游離細(xì)菌的儲(chǔ)藏所[9,10]。生物膜與多種細(xì)菌的毒力相關(guān)且參與致病過程，在耐藥性的發(fā)生、細(xì)菌的壓力應(yīng)答、規(guī)避宿主的防御機(jī)制和持續(xù)性感染中具有重要作用，因此生物膜的形成與細(xì)菌的耐藥性密不可分[9,11,12]。美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)報(bào)道指出：“超過80%的細(xì)菌感染與生物膜相關(guān)”，而且細(xì)菌在生物膜狀態(tài)下對(duì)藥物的抵抗能力是其游離狀態(tài)的10～1 000倍[13]。

關(guān)于這種天然耐藥性的分子機(jī)制，以往的研究提出以下幾種可能的解釋：生物膜的存在限制抗生素的滲透[14]；營養(yǎng)限制導(dǎo)致細(xì)菌生長代謝緩慢[15,16]；壓力耐受基因的激活表達(dá)[17]；群體效應(yīng)形成的特異表型[18,19]；外排泵(efflux pump)的表達(dá)增強(qiáng)[20]。大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，生物膜的耐藥性本質(zhì)是由于黏膜深處的細(xì)菌很少接觸抗菌藥物，然而這個(gè)理由并不充分。最近的研究揭示了生物膜耐藥的其他原因，如生物膜中頑固耐藥菌(persister cell)的存在[21]。

1.1 滲透限制

一直以來，抗生素不能有效穿透所有生物膜被認(rèn)為是細(xì)菌耐藥的普遍原因。細(xì)菌在生物膜狀態(tài)下的特征是密度大，有以多種不溶于水的胞外多糖為主要成分的胞外基質(zhì)，由此組成的網(wǎng)絡(luò)狀支持結(jié)構(gòu)形成阻礙抗生素穿透的屏障[19]。因此，抗生素只能殺滅表層細(xì)菌，無法以有效濃度滲透至生物膜內(nèi)部。Larsen等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)浮游狀態(tài)的牙齦卟啉菌(Porphyromonasgingivalis)的密度與生物膜狀態(tài)相當(dāng)時(shí)，盡管細(xì)菌在生物膜狀態(tài)下對(duì)多西環(huán)素(強(qiáng)力霉素)和甲硝唑的耐藥性是浮游狀態(tài)的2～8倍，但羥氨芐青霉素、多西環(huán)素和甲硝唑的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)顯著增加[22]。Roque等報(bào)道將金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的胞外基質(zhì)洗去后，細(xì)菌對(duì)藥物的敏感度上升到浮游狀態(tài)時(shí)的90%以上[23]。也有些研究提出其他觀點(diǎn)，如Stewart等發(fā)現(xiàn)達(dá)托霉素可以在數(shù)分鐘內(nèi)滲透到一株流行的金黃色葡萄球菌形成的生物膜中[24]。另外，一些學(xué)者研究獲得的結(jié)果相反，即盡管抗生素滲透整個(gè)生物膜，但細(xì)菌依然不敏感。由此可見，滲透限制并不能完全解釋生物膜的耐藥機(jī)制。

1.2 生長限制

許多研究者認(rèn)為，細(xì)菌在生物膜狀態(tài)下生長速率下降是細(xì)菌耐藥的重要原因之一[15,16]。生物膜造成營養(yǎng)物質(zhì)從外到內(nèi)呈現(xiàn)梯度下降，導(dǎo)致不同營養(yǎng)狀態(tài)下細(xì)菌的代謝速率不同，最底層的細(xì)菌往往處于持續(xù)性潛伏的靜止?fàn)顟B(tài)[25]。以往的研究表明，處于靜止?fàn)顟B(tài)不分裂的細(xì)菌會(huì)逃避大多數(shù)針對(duì)殺滅活躍狀態(tài)細(xì)菌的抗生素，因此一些研究者認(rèn)為這樣的生長緩慢狀態(tài)將降低細(xì)菌對(duì)大多數(shù)抗生素的敏感度。

1.3 頑固耐藥菌

頑固耐藥菌是指那些始終對(duì)抗生素具有抗性的細(xì)菌。早在60多年前，就發(fā)現(xiàn)在抗生素敏感細(xì)菌中存在極少的一部分耐受細(xì)菌，頑固耐藥菌與耐藥突變細(xì)菌不同，具有可逆性和非遺傳性[26]。然而，由于極難分離出足夠數(shù)量頑固耐藥菌用于實(shí)驗(yàn)，該相關(guān)領(lǐng)域的研究沉寂了40多年。最近在生物膜中發(fā)現(xiàn)了頑固耐藥菌，重燃起研究者的興趣。在細(xì)菌中某些調(diào)控程序性細(xì)胞死亡的基因發(fā)生突變可以增加頑固耐藥菌的耐藥性，表明細(xì)菌在生物膜狀態(tài)下發(fā)生的程序性細(xì)胞死亡與其耐藥有關(guān)。

2 細(xì)菌的程序性死亡

程序性細(xì)胞死亡最早由Lockshin 和Williams于1964年提出，也稱細(xì)胞凋亡(apoptosis)，是由細(xì)胞本身程序性自殺機(jī)制介導(dǎo)的細(xì)胞死亡現(xiàn)象[27]。該現(xiàn)象在真核多細(xì)胞生物中廣泛存在，是維系個(gè)體穩(wěn)定、功能平衡和正常發(fā)育所必需的。隨著微生物學(xué)研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌等原核生物在應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力帶來的生存危機(jī)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生與真核生物細(xì)胞凋亡相似的自殺現(xiàn)象，稱為細(xì)菌的程序性死亡[28,29]。

目前研究較多的介導(dǎo)程序性死亡的機(jī)制有2類：一類是在壓力應(yīng)激下由毒素抗毒素(toxin-antitoxin，TA)系統(tǒng)介導(dǎo)的，具代表性的是大腸埃希菌(Escherichiacoli)的mazEF操縱子；另一類是枯草芽胞桿菌(Bacilliussubtilis)在細(xì)胞功能分化過程中介導(dǎo)的程序性死亡[30,31]。

2.1 大腸埃希菌的TA系統(tǒng)

TA系統(tǒng)包括1對(duì)基本的組分，即一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的毒素基因與一個(gè)可干擾毒素反應(yīng)的不穩(wěn)定的抗毒素基因[31]。在大腸埃希菌中，被研究最清楚的是mazEF系統(tǒng)，它由2個(gè)定位于relA基因下游的鄰近基因mazE和mazF組成[32]。mazE編碼抗毒素蛋白MazE，mazF編碼毒素蛋白MazF[33]。一般情況下，MazE與MazF在細(xì)菌內(nèi)相互拮抗，不會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長產(chǎn)生影響。一旦有某種外界因素打破這種相對(duì)平衡的體系，由于MazE不穩(wěn)定容易被降解，MazF不斷積累，最終導(dǎo)致細(xì)菌的程序性死亡。這些因素包括氨基酸的過度缺乏[33,34]、抗生素(如奇霉素、利福平)的應(yīng)用[35]、Doc蛋白(一種廣譜翻譯抑制劑)的存在[36]、過氧化物(如H2O2)的應(yīng)用[37]、胸腺嘧啶缺乏、絲裂霉素的應(yīng)用、萘啶酸的存在和紫外照射等[37,38]。

也有學(xué)者認(rèn)為，TA系統(tǒng)導(dǎo)致細(xì)胞死亡僅僅是通過抑制大分子的表達(dá)而可逆地抑制細(xì)菌生長[39,40]，而毒素的存在使處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)菌在其相應(yīng)抗毒素基因表達(dá)時(shí)重新被激活的結(jié)果支持了上述觀點(diǎn)。

2.2 枯草芽胞桿菌的程序性死亡

一般情況下，在營養(yǎng)缺陷時(shí)，枯草芽胞桿菌容易形成芽胞，這一過程由調(diào)節(jié)蛋白Spo0A介導(dǎo)[41]。Losick等提出，程序性死亡過程延遲了枯草芽胞桿菌形成芽胞的時(shí)間[42,43]。當(dāng)營養(yǎng)缺陷時(shí)，群體中一部分細(xì)菌的Spo0A被激活，稱為“Spo0A-ON”細(xì)菌；剩下的細(xì)菌沒有被激活，稱為“Spo0A-OFF”細(xì)菌。“Spo0A-ON”細(xì)菌在芽胞形成早期，調(diào)節(jié)蛋白Spo0A上調(diào)表達(dá)skfA～H和sdpABC。skf操縱子在形成芽胞的過程中產(chǎn)生胞外殺傷因子，而skfE與skfF分別募集ATP結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體，從而將體內(nèi)的殺傷因子泵出。同時(shí)，sdpABC也被誘導(dǎo)表達(dá)。SdpC是一個(gè)具有毒性的信號(hào)蛋白，細(xì)胞自身由于具有sdpRI操縱子而對(duì)其產(chǎn)生抗性。一般情況下，sdpRI操縱子受AbrB的抑制，而Spo0A蛋白可抑制AbrB的表達(dá)，使細(xì)菌免受SdpC的傷害?！癝po0A-OFF”細(xì)菌由于不能表達(dá)Spo0A蛋白，不能對(duì)抗毒素及SdpC，故出現(xiàn)程序性死亡[31]。

2.3 細(xì)菌程序性死亡與耐藥

令人驚訝的是，其他細(xì)菌體內(nèi)也廣泛存在類似大腸埃希菌的TA系統(tǒng)，說明其在細(xì)菌生存過程中發(fā)揮一定作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，這種與生俱來的自殺現(xiàn)象與細(xì)菌生理學(xué)、細(xì)菌耐藥性和生物膜形成等有密切關(guān)系[26,44,45]。程序性死亡盡管在單個(gè)細(xì)菌中往往是一種消極反應(yīng)，卻有利于群體的生長。已知細(xì)菌程序性死亡的作用主要有如下幾方面。①抵抗噬菌體感染蔓延[46]。Hazan等的實(shí)驗(yàn)表明，溶源性噬菌體的感染對(duì)于缺失mazEF的大腸埃希菌是致死的，而同樣條件下野生細(xì)菌中檢測(cè)不到噬菌體，因?yàn)樗鼈兛赏ㄟ^MazEF的致死作用將那些已經(jīng)感染的細(xì)菌殺死，避免噬菌體感染的蔓延。②保持細(xì)菌群體基因的穩(wěn)定[47]。由于細(xì)菌的繁殖迅速，每次分裂染色體都會(huì)發(fā)生不同程度損傷，通常這種損傷可由細(xì)菌擁有的修復(fù)機(jī)制予以修復(fù)。在修復(fù)系統(tǒng)無法修復(fù)的情況下，由MazEF介導(dǎo)的程序性死亡被激活，清除那些基因損傷的細(xì)菌，從而保持群體的基因穩(wěn)定。③對(duì)營養(yǎng)極度缺乏的反饋。在營養(yǎng)物質(zhì)極度匱乏的環(huán)境中，細(xì)菌群體會(huì)通過使一部分細(xì)菌程序性死亡而獲得生存所需的營養(yǎng)，其代表是枯草芽胞桿菌的程序性死亡[33]。④與細(xì)菌耐藥相關(guān)?？股夭⒉恢苯託⑺兰?xì)菌，而是通過造成細(xì)菌損傷使其自殺。在抗生素存在時(shí)，那些像多細(xì)胞生物一樣可以從缺陷細(xì)胞的程序性死亡中獲取更多生存機(jī)會(huì)的細(xì)菌更易產(chǎn)生耐藥性，否則會(huì)導(dǎo)致群體死亡。限制那些經(jīng)過修復(fù)仍然有缺陷的細(xì)菌利用有限資源的能力對(duì)于細(xì)菌群體適應(yīng)環(huán)境是十分重要的。如頑固耐藥菌內(nèi)的程序性死亡過程是受抑制的，當(dāng)細(xì)菌群體受到抗生素威脅時(shí)，頑固耐藥菌比其他細(xì)菌更易產(chǎn)生耐藥性[26]。

3 結(jié)語

細(xì)菌耐藥是一個(gè)復(fù)雜的過程，與細(xì)菌本身、宿主和環(huán)境這幾個(gè)因素密不可分。其中，對(duì)細(xì)菌自身的研究格外重要。生物膜和細(xì)胞程序性死亡是細(xì)菌群體性行為的兩個(gè)典型方面，研究它們的機(jī)制必將成為認(rèn)識(shí)和對(duì)抗細(xì)菌耐藥的關(guān)鍵。

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