郝再彬，董振紅，李子院

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；2.公主嶺市第三高級(jí)中學(xué)，公主嶺136100；3.桂林工學(xué)院材料與化學(xué)系，桂林541004）

高品質(zhì)甜葉菊品系“1096”的組培快繁

郝再彬1，3，董振紅2，李子院3

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；2.公主嶺市第三高級(jí)中學(xué)，公主嶺136100；3.桂林工學(xué)院材料與化學(xué)系，桂林541004）

采用改良DNS等方法篩選出的生長(zhǎng)快、糖苷含量高的甜葉菊品系“1096”為材料，研究了不同外植體、不同激素種類和配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化和生根的影響。結(jié)果表明：以莖尖為外植體愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)率均最高；其次是帶腋芽莖段；再次為葉片。無腋芽莖段和無菌根均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但不能誘導(dǎo)成芽。莖尖不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0mg/L；葉片不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0mg/L+IAA 1.0mg/L；帶腋芽莖段不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5mg/L。不定芽繼代增殖培養(yǎng)采用MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L；在1/4MS+IBA 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L+1g/L活性炭的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，生根率可達(dá)100%，生根苗移栽后成活率達(dá)95%。

甜葉菊；組織培養(yǎng)；愈傷組織；試管苗

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni）又名“甜菊”、“甜草”（楊丹等，2005），是一種小型多年生菊科（Compositae）斯臺(tái)維亞屬草本植物，原產(chǎn)于南美巴拉圭高原（王貴民等，2007），幾個(gè)世紀(jì)以來甜葉菊一直被當(dāng)?shù)鼐用褡鳛樘鹞讹嬃巷嬘茫╕ao等，1999）。從甜葉菊葉片中提取出來的糖苷以其高甜度、低熱量、安全無毒（Matsui等，1996）等特點(diǎn)，逐漸受到糖尿病、肥胖癥患者的青睞；Chan等（2000）研究表明，甜葉菊糖苷中的stevioside有明顯的降壓功效，且無毒副作用；甜葉菊糖苷對(duì)小兒齲齒、肥胖癥、心臟病等均有防治功能和輔助療效（張賢澤等，1996）；在南美洲、東南亞、遠(yuǎn)東地區(qū)，甜葉菊糖苷已被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域（Bovanová等，1998）。甜葉菊為自交不育異花授粉植物，遺傳穩(wěn)定性差，0℃以下不能越冬，且種子發(fā)芽率低，僅靠種子繁殖無法滿足市場(chǎng)上對(duì)甜葉菊的需求。采用組織培養(yǎng)技術(shù)不僅能保持品種的優(yōu)良特性，還可不受外界條件的影響周年繁殖，在較短時(shí)間內(nèi)，即可繁育出大批種苗，因此利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)甜葉菊進(jìn)行快速繁殖具有廣闊的市場(chǎng)前景。本實(shí)驗(yàn)室采用改良DNS（郝再彬等，2006）方法篩選出的甜葉菊優(yōu)良品系，編號(hào)“1096”主要特征如下：1）干葉中甜葉菊糖苷的含量為15%；2）植株的平均高度為1.5m；3）葉片大，平均24個(gè)節(jié)數(shù)，莖稈粗壯，生長(zhǎng)迅速，適應(yīng)性強(qiáng)；公頃產(chǎn)干葉片平均為2250kg；4）抗旱能力強(qiáng)，具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。近幾年國(guó)內(nèi)外已有一些關(guān)于甜葉菊組織培養(yǎng)的報(bào)道（呂榮華等，1998；黃蘇珍等，1999；Sivaram等，2003；赫福霞等，2005；Uddin等，2006；董振紅等，2008）。本試驗(yàn)在總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，探討了高品質(zhì)甜葉菊品系“1096”的組織培養(yǎng)條件，以期建立“1096”穩(wěn)定的植株再生體系，為其在生產(chǎn)上的應(yīng)用推廣以及開展基因工程育種等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甜葉菊品系“1096”。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體和消毒取“1096”側(cè)枝的幼嫩莖尖、葉片、莖尖誘導(dǎo)成苗的無菌苗帶腋芽和無腋芽莖段及無菌根為外植體。莖尖及葉片先用蒸餾水沖洗干凈，然后在超凈工作臺(tái)上用70%的酒精消毒10s，無菌水沖洗1～2次，再用0.1%的升汞（HgCl2）溶液浸泡4min，無菌水沖洗4～5次后，即可進(jìn)行接種培養(yǎng)。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)莖尖：用鑷子掐取已消毒好的莖尖端約0.5cm，接種于莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，4周后計(jì)算增殖倍數(shù)，計(jì)算公式如下：增殖倍數(shù)=分化出的總不定芽數(shù)/成活外植體數(shù)×100%。葉片：將葉片切成0.5cm2左右的小塊，接種于葉片誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（表2）。試管苗無腋芽莖段切成厚度為0.2cm左右的小圓片，無菌根段切成0.5cm左右的小段，分別接種于附加KT 1.0mg/L，6-BA 1.0 mg/L，IAA 1.0 mg/L，NAA 0.1 mg/L，CH 400 mg/L的1/4MS，1/2MS及MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理分別接種40個(gè)外植體，定期觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)當(dāng)不定芽長(zhǎng)至1～2cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)入以下繼代培養(yǎng)基，D1：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L；D2：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L；D3：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L；D4：MS+6-BA 1.0mg/L+ NAA 1.0mg/L，進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，定期觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.4 不定芽生根及移栽將長(zhǎng)至2cm左右的不定芽從愈傷組織上切下，接種于以下培養(yǎng)基，E1：1/4 MS+ IBA 0.1mg/L；E2：1/4MS+IBA 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L；E3：1/4MS+NAA 0.1mg/L；E4：1/4MS，誘導(dǎo)生根，定期觀察統(tǒng)計(jì)根的生長(zhǎng)情況；待苗長(zhǎng)出發(fā)達(dá)的根系后，先敞口煉苗2d，在含1/8MS+IBA 0.05mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖15g/L的培養(yǎng)液中浸根2d，然后洗凈根系上的培養(yǎng)基（黃寧珍等，2007），將苗轉(zhuǎn)入裝有土沙的小塑料培養(yǎng)杯中，并澆少量培養(yǎng)液（1/20MS），室溫陰濕處放置4～5d，每1～2d澆1次水，待小苗成活后，溫度適宜時(shí)再移于大田栽培。

1.2.5 培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度60%～70%，光照強(qiáng)度2000～3000μmol/（m2.s），先暗培養(yǎng)2d，再進(jìn)行24h/d的光培養(yǎng)?；九囵B(yǎng)基MS，附加3%蔗糖、6%瓊脂，各培養(yǎng)基在高壓滅菌前pH均調(diào)至5.8。

表1 6-BA對(duì)“1096”莖尖不定芽誘導(dǎo)的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織與不定芽的誘導(dǎo)

2.1.1 6-BA對(duì)莖尖愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化的影響在不加任何激素的培養(yǎng)基中，莖尖無愈傷組織及不定芽的分化，但3～4d后，在附加6-BA 0.5、1.0、1.5mg/L的培養(yǎng)基中外植體基部有的已開始膨大，5～7d后開始有嫩綠的不定芽出現(xiàn)，同時(shí)部分外植體基部形成愈傷組織。隨著小芽的不斷長(zhǎng)高，在芽的基部出現(xiàn)數(shù)量不等的叢生芽（圖1-A），4周后，6-BA濃度為1.0mg/L時(shí)，不定芽增殖最多（表1）。故MS+6-BA 1.0mg/L為“1096”莖尖不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基。

2.1.2 不同激素組合對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響添加不同激素的培養(yǎng)基對(duì)“1096”葉片愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響不同（表2）。經(jīng)過3周左右的培養(yǎng)，甜葉菊葉片切塊在不同培養(yǎng)基中均有愈傷組織形成，并隨培養(yǎng)天數(shù)的增加，逐漸增多，其中單獨(dú)添加6-BA以及6-BA與NAA組合，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，都可達(dá)到100%，其誘導(dǎo)出的愈傷組織均呈致密綠色小顆粒狀（圖1-B），但這些愈傷組織或不能再繼續(xù)分化或分化率極低，且要到6周后才有芽點(diǎn)出現(xiàn)，8周后小芽才可長(zhǎng)大到足以切下進(jìn)行繼代培養(yǎng)；6-BA與IAA組合都僅在葉片切口處形成少量的愈傷組織，3周后即可在切口處或葉塊中央不同位置看到小的叢生芽（圖1-C），6周后即可進(jìn)行繼代培養(yǎng)。由表2中的統(tǒng)計(jì)情況可知最佳的葉片不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為B6。

2.1.3 不同濃度激素組合對(duì)帶腋芽莖段誘導(dǎo)及分化的影響在C1和C3培養(yǎng)基（表3）中，帶腋芽莖段接種3～4d后腋芽就開始萌發(fā)，7d后開始在基部形成愈傷組織，4周后萌發(fā)的小苗已具有3～5片正常葉，其中C3培養(yǎng)基中平均出芽數(shù)最高，而C2、C4培養(yǎng)基中4周后會(huì)發(fā)現(xiàn)個(gè)別莖段的基部有褐化出現(xiàn)，個(gè)別芽從新生的葉片上長(zhǎng)出，形態(tài)不規(guī)則（圖1-D），平均出芽數(shù)也沒有另兩組培養(yǎng)基高。故C3為甜葉菊帶腋芽莖段愈傷組織誘導(dǎo)及分化最適培養(yǎng)基。

2.1.4 不同培養(yǎng)基對(duì)無腋芽莖段及無菌根愈傷組織誘導(dǎo)的影響4周后觀察，在幾種培養(yǎng)基中無腋芽莖段愈傷組織誘導(dǎo)率都在90%以上，但以MS中的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)最好，呈淡綠色顆粒狀（圖1-E），1/4MS，1/2MS中為淡黃色或淺褐色；無菌根段的出愈率分別為45%，85%和50%，1/2MS中的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)明顯好于其他兩種培養(yǎng)基，呈疏松顆粒狀（圖1-F），但都有不同程度的褐化出現(xiàn)，且無論哪種愈傷組織都沒能誘導(dǎo)出芽。

2.2 繼代增殖培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同激素組合進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)。4周后觀察，D2組增殖倍數(shù)達(dá)15.6（圖1-G），最適宜甜葉菊的繼代增殖培養(yǎng)，D3組次之，增殖倍數(shù)為14.3；但是D1，D4組增殖倍數(shù)都不及10，D2、D3組合4周后如不及時(shí)轉(zhuǎn)瓶，就會(huì)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，說明等濃度使用6-BA，NAA兩種激素可降低組織培養(yǎng)中的褐化率。

表2 激素組合對(duì)“1096”葉片愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響

表3 激素組合對(duì)“1096”帶腋芽莖段誘導(dǎo)及分化的影響

2.3 不定芽的生根與移栽

生根培養(yǎng)1周左右即可見E1～E3中陸續(xù)生根，40d后觀察（表4），E2中誘導(dǎo)出的根，長(zhǎng)、粗適宜，苗壯（圖1-H），移栽更易成活，E4培養(yǎng)基上苗的葉色較前幾種培養(yǎng)基中的稍淡，呈黃綠色，但不影響株高的生長(zhǎng)，且也長(zhǎng)出了極少量的不定根；試管苗移栽到小培養(yǎng)杯30d后觀察發(fā)現(xiàn)，E1～E3組（表4）苗均長(zhǎng)至10cm以上，葉色鮮綠，莖不斷長(zhǎng)高增粗，60d后，E2組苗長(zhǎng)勢(shì)最好，表現(xiàn)為莖粗，葉肥大，苗較高（圖1-I），成活率最高達(dá)95%；但E4組，無論是苗的長(zhǎng)勢(shì)還是成活率都遠(yuǎn)不及前三組，說明誘導(dǎo)出良好的根系是甜葉菊移栽成功的關(guān)鍵。

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)“1096”不定芽生根的影響

圖1 不同外植體從誘導(dǎo)到成苗及移栽的各個(gè)階段

3 討論

3.1 外植體的選擇

甜葉菊進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，外植體的選取至關(guān)重要。在本試驗(yàn)所選取的外植體中，因培養(yǎng)基篩選范圍有限，其中葉片的誘導(dǎo)出芽率低，不到50%，但婁玉霞等（2000）研究認(rèn)為，在添加BA 0.5mg/L和NAA 0.05mg/L的MS培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)葉片愈傷組織分化不定芽，分化頻率為100%，可能是因?yàn)樗貌牧喜煌?，?dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不同。無腋芽莖段、無菌根則不能誘導(dǎo)出芽，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)、篩選。選用“1096”莖尖及試管苗帶腋芽莖段為外植體，無論是愈傷組織誘導(dǎo)率，還是出芽率都較為理想，這可能與其較強(qiáng)的分生能力有關(guān)。

3.2 繼代增殖培養(yǎng)

在植物組織培養(yǎng)過程中，由愈傷組織分化為根和芽是由細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素含量的比值決定的，比值高時(shí)，促進(jìn)芽的形成。故本試驗(yàn)采用調(diào)整6-BA與NAA的濃度比例，來提高叢生芽的分化率。

3.3 不定芽生根及移栽

IBA和NAA均可誘導(dǎo)不定芽生根，但I(xiàn)BA誘發(fā)的根細(xì)長(zhǎng)，而NAA誘發(fā)的根短粗，將二者結(jié)合使用，則起到了一定的加合作用，誘發(fā)出的根具有長(zhǎng)、粗、多等特點(diǎn)；移栽最好待試管苗長(zhǎng)至5～7cm以上，根系發(fā)達(dá)時(shí)進(jìn)行，此時(shí)苗的抗性較強(qiáng)，根系較完全，易于成活。為了避免感染細(xì)菌，開口煉苗2～3d為宜。在培養(yǎng)液中培養(yǎng)不應(yīng)超過2d，否則培養(yǎng)液會(huì)因感染細(xì)菌而渾濁。如培養(yǎng)液已經(jīng)出現(xiàn)渾濁，應(yīng)先將苗用70%的酒精消毒處理后再移栽。移栽后觀察發(fā)現(xiàn)用1/20的培養(yǎng)液浸過的土壤較未浸過的易感染病菌，所以在以后的重復(fù)試驗(yàn)中采用水來代替1/20培養(yǎng)液。

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Tissue Culture Propagation of High Quality Stevia rebaudiana Bertoni Strain"1096"

HAO Zai-bin1，3；DONG Zhen-hong2；LI Zi-yuan3
（1.College of Life Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang150030，China；2.The Third Senior Middle School of Gongzhuling，Gongzhuling，Jilin 136100，China；3.Department of Material and Chemistry，Guilin University of Technology，Guili，Guangxi 541004，China）

The effects of different combinations of growth substances and explants on callus induction，bud differentiation and root formation were investigated in rapid growth and high steviol-glucosides content Stevia rebaudiana Bertoni Strain"1096"，which was screened by improved DNS method.The results showed that stem apex seemed to be the best explant for callus induction and bud differentiation，followed by stem segment with axillary bud and the third was leaf.Both the stem segment without axillary bud and root of plantlets could be induced to form calli but not adventitious buds.The optimal combinations of 6-BA for adventitious bud induction on stem apex was 1.0mg/L，on stem segment with axillary bud was 1.5mg/L on MS medium；The best adventitious buds induction medium from leaves was MS medium with 1.0mg/L 6-BA and 1.0mg/L IAA.The proliferation culture medium for bud differentiation was MS medium with 0.5 mg/L 6-BA and 0.05 mg/L NAA.Rooting medium is 1/4MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1mg/L+active carbon l.0g/L，the rooting rate reached up to 100%，transplant survive was 95%.

Stevia rebaudiana Bertoni；tissue culture；callus；plantlet

S566.9

A

1007-2624（2011）03-0009-03

2011-02-16

黑龍江省教育廳（11511033）；廣西科技廳（桂科回0731021）；桂林理工大學(xué)；廣西環(huán)境工程與保護(hù)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（桂科能0701K017）；廣西新材料及其制備新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（桂科能0842003-35）。

郝再彬（1958-），男，黑龍江省哈爾濱市人，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：haozaibin2010@126.com