耿小麗,魏臻武 ,姚喜紅

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院,甘肅 蘭州730070;2.揚州大學動物科學與技術學院,江蘇 揚州225009)

紫花苜蓿(Medicago sativa)是多年生異花授粉豆科作物。自然環(huán)境下絕大多數(shù)紫花苜蓿為同源四倍體(2n=4x=32),少數(shù)為四倍體的變異體。苜?；ㄋ幣囵B(yǎng)時,由于小孢子在形成愈傷組織的過程中,經(jīng)歷了連續(xù)不斷的有絲分裂過程,因此,染色體水平上發(fā)生變異的可能性大大增加。這種遺傳變異具有雙重性,一方面可以利用有益變異為育種工作服務,另一方面變異的不確定性又為優(yōu)良性狀的保持帶來了極大的困難[1]。因此,在育種過程中,掌握愈傷組織的遺傳變異規(guī)律就顯得尤為重要。Larkin和Scowcroft[2]指出植物組織培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)可遺傳的變異,并將組織和細胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的變異稱為體細胞無性系變異。Yoshida等[3]在水稻(Oryza sativa)花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),愈傷組織繼代時間越長,變異率越高。Muller等[4]利用RFLP(restriction fragment length polymorphism)分子標記研究不同繼代時間對無性系變異的影響時,發(fā)現(xiàn)延長繼代時間可增加體細胞無性系DNA的多態(tài)性。不同植物染色體數(shù)目的穩(wěn)定性存在差異,谷明光[5]發(fā)現(xiàn)玉米(Zea mays)花粉愈傷組織倍性較為穩(wěn)定。

染色體計數(shù)法是植物研究中最常用的染色體檢測方法[6]。此方法雖然準確性高,但操作復雜,觀察細胞群體小,難以實現(xiàn)大量材料的倍性鑒定[7,8]。本試驗所采用的流式細胞儀可以同時對大量細胞進行染色體檢測,提高了結果準確度,并且DNA變異可在分布圖上直觀地表現(xiàn)。此外,流式細胞儀還可以快速地鑒定細胞周期。

本試驗采用流式細胞儀對3個基因型8個繼代周期的苜?；ㄋ幱鷤M織DNA含量進行測定及遺傳變異分析,旨在研究苜蓿花藥愈傷組織染色體的變異現(xiàn)象,為紫花苜蓿優(yōu)良品種選育提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為自選系大葉0510、自選系多葉0501、Sanditi的單株,3個材料種植于甘肅省皋蘭縣試驗基地。試驗于2008年5月開始。

1.2 苜?；ㄋ幱鷤M織的誘導培養(yǎng)

在苜蓿初花期到盛花期期間,采集3個基因型紫花苜蓿單株上花藥發(fā)育處于單核中、晚期的花蕾(使用醋酸洋紅染色壓片法,觀察、確定發(fā)育時期。從外觀上選擇花冠最外面的旗瓣緊包,花冠飽滿,伸出花萼1～2mm,呈刀尖狀的花蕾)。將采集的花蕾放置在4℃的冰箱內(nèi)低溫處理12～24 h;然后將花蕾滅菌,在無菌條件下剝出花粉,接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基中(NB+0.5 g/L 2,4-D+0.2 g/L NAA+0.5 g/L 6-BA+2 g/L KT+9%蔗糖+0.7%瓊脂),在溫度為25℃、光強1 000 lx、光照時間16 h/d、濕度40%的環(huán)境下培養(yǎng)。誘導出愈傷組織后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基(NB+3%蔗糖+0.7%瓊脂),20 d為1個繼代周期。培養(yǎng)條件同上。

1.3 采用流式細胞儀測定苜蓿愈傷組織DNA含量

本試驗使用德國Partec公司PA-1型流式細胞儀進行DNA含量的檢測。每1個基因型的愈傷組織每次測定5 000個細胞,重復3次。

1)用鋒利的刀片對愈傷組織和葉片進行機械破碎,破碎過程中加入700～800 mL的緩沖液A[15 mmol/L T ris-HCl(pH 7.5),80 mmol/L KCl,20 mmol/L NaCl,2 mmol/L EDTA-Na2,15 mmol/L巰基乙醇,0.1%(V/V)T ritonX-100,0.5 mmol/L精氨四鹽酸(spermine·4HCl)],在緩沖液A中處理10 min。然后用300目(48 μ m)尼龍網(wǎng)過濾(濾液含1×105～2×105個細胞),將濾液離心(2 000 r/min,5 min)。離心后棄去上層清液,取沉淀物加緩沖液A(700～800 mL),打散后用300目尼龍網(wǎng)過濾。取濾液離心(2 000 r/min,5 min),離心后棄去上層清液,取沉淀物加 RNase A溶液(50 mg/L)1 mL,處理10 min,去除RNA,然后離心(2 000 r/min,5 min)。離心后棄去上層清液,取沉淀物加入1.6 mL HR-B DAPI染色液(partec high resolution staining kit)染色30～60 s,完成細胞核染色,細胞核懸浮液制備完成。

2)以已知的四倍體苜蓿葉片(2n=4x=32)為對照。調(diào)整分析儀的放大倍數(shù),使對照的DNA峰值處在200道附近。峰值處在100道的樣本為二倍體,而處在300和400道的分別為三倍體和八倍體,其余的為嵌合體。嵌合體又根據(jù)峰值位置確定其構成細胞的倍性。

3)將1)所得細胞核懸浮液用調(diào)整好的流式細胞儀進行檢測,DNA含量的分布曲線圖由儀器自動生成。

1.4 統(tǒng)計分析

用DPAC(Data Pool Application of Cytometre)軟件分析DNA含量的分布曲線圖,得出S期細胞百分率和DNA含量整倍性變異與非整倍性變異細胞百分率,采用SPSS 10.0軟件分析愈傷組織繼代時間與DNA含量變異率之間的關系。

2 結果與分析

2.1 苜蓿花藥愈傷組織DNA含量分布曲線圖的分析

將苜蓿愈傷組織細胞核懸浮液和苜蓿葉片細胞核懸浮液放入流式細胞儀進行DNA含量的測定,檢測完畢后流式細胞儀自動生成DNA含量分布曲線圖。

自選系大葉0510(2n=4x=32)葉片DNA含量分布曲線圖中出現(xiàn)1個G1/G0峰值,峰值在200道附近(圖1)。自選系大葉0510花藥愈傷組織繼代3周后的曲線圖,除1個主峰外還有1個峰,位置位于主峰DNA含量2倍的地方(圖2)。主峰峰值為107.23,第2個峰的峰值為194.16,它們的比值約等于2。由此可看出自選系大葉0510花藥愈傷組織的一部分細胞倍性發(fā)生了變異。

其余23個樣本的DNA含量分布曲線圖均表現(xiàn)出與此相似的分布曲線,即DNA含量分布曲線圖上均出現(xiàn)第2個峰,愈傷組織的一部分細胞倍性都發(fā)生了變異。另外,Sanditi的2個繼代周期的樣本、自選系大葉0510一個繼代周期的樣本DNA含量分布曲線圖上還出現(xiàn)了3個峰的現(xiàn)象。說明愈傷組織在培養(yǎng)過程中不僅出現(xiàn)了染色體加倍的現(xiàn)象,而且出現(xiàn)了多倍性變異和非整倍變異的現(xiàn)象。

2.2 苜蓿花藥愈傷組織S期細胞百分率及DNA含量變異率的分析

愈傷組織DNA含量出現(xiàn)加倍的現(xiàn)象,可能是愈傷組織出現(xiàn)了多倍性變異,也可能是愈傷組織細胞處于有絲分裂S期,DNA進行復制導致DNA含量加倍。為了證實DNA含量加倍是多倍性變異引起的還是由于細胞處于S期而出現(xiàn)的,采用DPAC分析軟件對愈傷組織DNA含量分布曲線圖進行分析,得到了自選系大葉0510、自選系多葉0501、Sanditi 8個繼代周期愈傷組織DNA含量變異細胞百分率和S期細胞百分率(表1)。

圖1 自選系大葉0510葉片DNA含量分布曲線圖(對照)Fig.1 DNA content distribution of M.sativa leave(as control)

圖2 自選系大葉0510花藥愈傷組織DNA含量分布曲線圖Fig.2 DNA content distribution of M.sativa callus

表1 3個基因型8個繼代周期的紫花苜蓿愈傷組織DNA含量變異百分率和S期細胞百分率Table 1 The percentage of DNA content variation cells and the percentage of S stage cells of M.sativa callus

自選系大葉0510、自選系多葉0501、Sanditi的花藥愈傷組織的8個繼代培養(yǎng)周期的樣本都出現(xiàn)DNA含量變異現(xiàn)象(表1),且不同基因型、不同繼代時間DNA含量變異率都不相同。變異最大的是自選系大葉0510繼代15周時的樣本,DNA含量變異率達到19.45%。變異最小的是自選系多葉0501未經(jīng)過繼代培養(yǎng)的樣本,DNA含量變異率為2.05%。

在8個繼代培養(yǎng)周期中,自選系大葉0510的愈傷組織有5個階段S期細胞百分率為0,不處于S期(表1);自選系多葉0501有2個階段不處于S期;Sanditi有3個階段不處于S期,這10個樣本真正出現(xiàn)了多倍性變異。另外,自選系大葉0510愈傷組織繼代9周的樣本、自選系多葉0501愈傷組織繼代15周的樣本、Sanditi愈傷組織繼代15周的樣本,DNA含量變異細胞百分率都大于S期細胞百分率,說明這3個階段的愈傷組織也出現(xiàn)了多倍性變異。從以上得出24個樣本中有13個樣本出現(xiàn)了多倍性變異,這表明約65%的愈傷組織真正出現(xiàn)了多倍性變異。由此可知,在紫花苜蓿愈傷組織中倍性變異是普遍存在的。另外,自選系大葉0510有2個繼代培養(yǎng)階段,自選系多葉0501有5個階段,Sanditi有4個階段愈傷組織的S期細胞百分率大于DNA含量變異細胞百分率,其原因可能是細胞分裂的非同步性造成的。細胞分裂在S期內(nèi)不同的細胞所處狀態(tài)不同,就可能出現(xiàn)S期細胞百分率較大而DNA含量變異細胞百分率較小的現(xiàn)象。細胞處在分裂間期的S期時,DNA進行復制,含量也會加倍,這會引起DNA含量變異細胞百分率增高,S期及細胞分裂結束后DNA含量變異細胞百分率會略有下降。

S期細胞數(shù)占整個細胞群體數(shù)目的比率反映細胞分裂程度。自選系大葉0510的愈傷組織在繼代3周時細胞開始分裂,繼代9周時停止分裂(表1)。自選系多葉0501未經(jīng)繼代的樣本細胞已經(jīng)開始分裂,繼代15周時細胞停止分裂。Sanditi愈傷組織繼代培養(yǎng)3周時細胞開始分裂,繼代培養(yǎng)15周時停止分裂。說明紫花苜蓿愈傷組織品種間的細胞周期長短存在差異,自選系多葉0501愈傷組織生長周期最長,其次為Sanditi,而自選系大葉0510愈傷組織生長周期最短。

2.3 培養(yǎng)時間與DNA含量變異率之間的相關分析

通過DPAC軟件對苜蓿花藥愈傷組織DNA含量分布曲線圖的分析表明,3個基因型花藥愈傷組織繼代時間不同,DNA含量變異細胞百分率也不同。

自選系大葉0510、自選系多葉0501、Sanditi的花藥愈傷組織繼代時間與DNA含量變異率之間的相關系數(shù)分別是r2=0.792(P<0.05)、r2=0.826(P<0.05)、r2=0.843(P<0.05)(圖3～5),這說明二者具有相關性。自選系大葉0510的花藥愈傷組織DNA含量變異細胞百分率在一定時間內(nèi),隨著繼代時間的增長,呈增加趨勢。DNA含量變異細胞百分率在繼代0～12周時迅速增加,為集中變異期。之后,隨著繼代次數(shù)的增加,逐漸趨于穩(wěn)定。自選系多葉0501、Sanditi花藥愈傷組織8個繼代培養(yǎng)時間段中,DNA含量變異細胞百分率的時相分布呈相同的趨勢。

圖3 自選系大葉0510花藥愈傷組織在8個時間段中DNA含量變異細胞百分率時相分布Fig.3 Percentage of DNA content variation cells distribution of M.sativa callus in eight periods

圖4 自選系多葉0501花藥愈傷組織在8個時間段中DNA含量變異細胞的百分率時相分布Fig.4 Percentage of DNA content variation cells distribution of M.sativa callus in eight periods callus

3 討論

圖5 Sanditi花藥愈傷組織在8個時間段中DNA含量變異細胞的百分率時相分布圖Fig.5 Percentage of DNA content variation cells distribution of M.sativa callus in eight periods

本試驗通過流式細胞儀對3個基因型8個繼代周期的苜蓿愈傷組織DNA含量進行測定,結果表明,在紫花苜蓿愈傷組織中倍性變異普遍存在。這與在玉米[5]、小麥(Triticum aestivum)[9,10]中的研究結果相同。絕大多數(shù)愈傷組織的第2個峰值是第1個峰值的2倍。這是因為,正在進行分化的細胞中,DNA不斷地周期性復制,而不進入有絲分裂,結果產(chǎn)生多倍體細胞,這些細胞在正常條件下不再分裂,在離體條件下能誘導這些細胞分裂,則導致愈傷組織細胞倍性變異[15,16],愈傷組織的誘導階段是體細胞變異的關鍵階段,細胞的啟動分裂也可能導致倍性變異[2]。苜蓿愈傷組織在培養(yǎng)過程中不僅出現(xiàn)了染色體加倍的現(xiàn)象,而且出現(xiàn)了多倍性變異和非整倍性變異。細胞倍性的變化表現(xiàn)出遺傳的不穩(wěn)定性,整倍體、非整倍體、混合體在許多植物的組培過程中都會出現(xiàn)[11,12]。這是由于在愈傷組織細胞中進行較多的無絲分裂,難以保證子細胞中染色體的穩(wěn)定性,從而產(chǎn)生各種染色體數(shù)目變異,有絲分裂異常也可能導致子細胞中染色體數(shù)目和結構的變異[13,14]。但是,在愈傷組織中有DNA含量加倍的現(xiàn)象是否就一定是染色體數(shù)目發(fā)生變化,不能僅僅通過DNA含量分布來下結論,還需對其進行細胞周期分析。因為細胞處在分裂間期的S期時,DNA進行復制時DNA含量也會出現(xiàn)加倍的現(xiàn)象。

愈傷組織在繼代過程中會發(fā)生大量的變異,長期繼代的愈傷組織不僅分化能力下降,而且繼代時間越長,變異越復雜,變異率越高[17,18]。本試驗通過分析不同繼代周期愈傷組織DNA變異細胞的百分率,發(fā)現(xiàn)隨著繼代時間的增長,染色體變異有增加的趨勢。但是,這種趨勢并不是隨著時間的增長,無限增加的。繼代0～12周是愈傷組織變異的高發(fā)期,以后隨著繼代次數(shù)的增加,變異趨向于穩(wěn)定。這個結果可能是由于多倍體變異細胞在不斷產(chǎn)生的同時也通過細胞程序性死亡途徑不斷被淘汰[19～21]形成的,所以DNA含量變化的細胞比例總在一定的范圍之內(nèi)。其他作物上也出現(xiàn)了相同的情況,如水稻愈傷組織在試管中繼代時間越長,發(fā)生變異率越高[3]。繼代20周的水稻花藥再生植株發(fā)生性狀改變的比例高達88%,而繼代4～6周的再生植株發(fā)生性狀改變的比例為63%;從染色體水平來看,愈傷組織繼代時間不同,再生植株內(nèi)染色體組的倍性變化也不同,不進行繼代培養(yǎng)而分化成苗所形成的再生植株中單倍體、二倍體和多倍體的比例分別為57%,43%和0;但如果愈傷繼代4～6周,再生植株中3種倍性植株的比例為20%,84%和3%;繼代20周的愈傷再生植株中,這3種倍性植株的比例為7%,85%和11%[3]。Muller等[4]利用RFLP分子標記來研究不同繼代時間對無性系變異的影響發(fā)現(xiàn)繼代9周的愈傷再生植株RFLP多態(tài)性為23%,而繼代4周的RFLP多態(tài)性為6.3%,說明長時間繼代培養(yǎng)可增加體細胞無性系DNA的多態(tài)性。這意味著在植物組織培養(yǎng)過程中,減少繼代次數(shù)或避開變異高發(fā)期可減少愈傷組織階段的變異,進而獲得遺傳穩(wěn)定性高的再生植株。通過分析不同繼代次數(shù)愈傷組織的變異,可以更好的利用和避免紫花苜蓿組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)體細胞變異。

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