林仕梅 潘 瑜 羅 莉 馬 霞 詹若蕊 毛述宏
微量元素是動(dòng)物維持生命和生產(chǎn)必不可少的營(yíng)養(yǎng)素之一,在動(dòng)物飼料中含量雖少,但它們直接或間接地參與機(jī)體幾乎所有生理和生化過(guò)程,與動(dòng)物生長(zhǎng)和健康密切相關(guān)。微量元素缺乏或過(guò)量都會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物生物化學(xué)的、結(jié)構(gòu)的和功能性的病理學(xué)變化[1-2]。當(dāng)今對(duì)微量元素的認(rèn)識(shí),無(wú)論是從動(dòng)物種類(lèi)上、微量元素形式上,還是微量元素供給量以及比例上都有巨大的變革和突破,它對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)、繁殖、免疫、抗病、體形、體色以及肉質(zhì)等都會(huì)產(chǎn)生較大的影響[2-4]。影響微量元素生物利用率的因素很多,如動(dòng)物機(jī)體的生理狀態(tài)、微量元素的化學(xué)形式和數(shù)量以及飼料中存在的一些抗?fàn)I養(yǎng)因子[5-6]。動(dòng)物對(duì)微量元素利用的高低還取決于其吸收狀況,而微量元素的形式是影響其吸收
和利用的主要因素之一。通常,水產(chǎn)飼料中都是以無(wú)機(jī)鹽形式補(bǔ)充微量元素。無(wú)機(jī)鹽形式的微量元素存在著難吸收、生物利用率低、生化功能差和對(duì)環(huán)境污染大的缺點(diǎn)。氨基酸微量元素具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、分子量低、易吸收、生物學(xué)效價(jià)高等特點(diǎn)[7-8],已引起動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家和飼料生產(chǎn)者的高度關(guān)注[9-10],并已廣泛地應(yīng)用到畜禽飼料工業(yè)中[4,7,11],而在水產(chǎn)飼料中相關(guān)的研究報(bào)道較少,少量的報(bào)道也僅局限在單一的氨基酸微量元素上[12-13],有關(guān)復(fù)合氨基酸微量元素的研究則未見(jiàn)報(bào)道。為此,本試驗(yàn)以吉富羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)為試驗(yàn)對(duì)象,在實(shí)用飼料配方的基礎(chǔ)上,探討氨基酸微量元素對(duì)羅非魚(yú)生長(zhǎng)、代謝和非特異性免疫力的影響,以期為氨基酸微量元素在水產(chǎn)飼料中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。
微量元素鐵 (Fe)、鋅(Zn)、錳 (Mn)、銅 (Cu)分別以無(wú)機(jī)微量元素、氨基酸微量元素和氨基酸微量元素組合體形式添加到吉富羅非魚(yú)實(shí)用飼料(粗蛋白質(zhì) 32%,總能 14 MJ/kg)中,組成3種試驗(yàn)飼料,其中無(wú)機(jī)微量元素為 FeSO4?H2O、ZnSO4? H2O、MnSO4? H2O、CuSO4? 5H2O,均為飼料級(jí),由成都蜀星飼料有限公司提供;氨基酸微量元素為氨基酸螯合鐵[Fe 15%(15.42%),氨基酸(AA)30%]、氨基酸螯合鋅 [Zn 15%(15.46%),AA 30%]、氨基酸螯合錳[Mn 10%(10.11%),AA 20%]、氨基酸螯合銅[Cu 15%(15.35%),AA 30%],由施普諾生物技術(shù)(成都)有限公司提供,括號(hào)內(nèi)為實(shí)測(cè)值;氨基酸微量元素組合體為氨基酸與 Fe、Zn、Mn、Cu螯合的組合體,即按比例稱(chēng)取微量元素混勻后,與氨基酸進(jìn)行螯合反應(yīng)配制而成,其中 Fe 8.98%、Zn 4.18%、Mn 1.46%、Cu 0.24%,均為實(shí)測(cè)值,由施普諾生物技術(shù)(成都)有限公司提供。
試驗(yàn)飼料 1(無(wú)機(jī)組)中微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu的添加量分別為 160、80、28、4 mg/kg,試驗(yàn)飼料 2(有機(jī)組)和 3(有機(jī)組合體組)中 Fe、Zn、Mn、Cu添加量均為試驗(yàn)飼料 1添加量的 50%,即分別為 80、40、14、2 mg/kg。 3種試驗(yàn)飼料中 Fe、Zn、Mn、Cu保持相同的比例 ,即均為 40∶20∶7∶1。此外,以不添加微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu的試驗(yàn)飼料為對(duì)照飼料。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表 1。飼料原料均為符合國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的飼料級(jí)原料,飼料原料均粉碎過(guò) 40目篩,飼料調(diào)質(zhì)溫度為80℃,分別制成直徑為 2.5 mm的硬顆粒飼料,60℃烘干后保存于 -15℃冰柜中備用。
試驗(yàn)魚(yú)選用當(dāng)年培育的全雄性吉富羅非魚(yú)魚(yú)苗,取自重慶璧山縣魚(yú)種場(chǎng)。馴食適應(yīng)環(huán)境 10 d后,選取體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊、平均體重為(27.2±0.1)g的吉富羅非魚(yú) 360尾,隨機(jī)分成4組,每組設(shè) 3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù) 30尾魚(yú),以重復(fù)為單位飼養(yǎng)在室內(nèi)淡水循環(huán)玻璃水族箱(有效體積為 250 L)中。日投喂率為體重的 4% ~6%,每天 08:30、12:30和 17:30各投喂 1次,每 2周稱(chēng)重 1次,根據(jù)體重調(diào)整投飼量。每天早上清除箱內(nèi)糞便,并換水 1/4。飼養(yǎng)時(shí)間為 8周。養(yǎng)殖水源為曝氣自來(lái)水,試驗(yàn)期間定時(shí)對(duì)水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控,養(yǎng)殖全程水溫為(27.8±2.2)℃,pH為 7.4±0.4,溶解氧 >6.5 mg/L,氨氮 <0.50 mg/L,亞硝酸鹽 氮 <0.06 mg/L。
飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束,禁食 24 h后稱(chēng)重,計(jì)算特定生長(zhǎng)率、成活率、蛋白質(zhì)效率和飼料系數(shù);每箱取 3尾魚(yú)作為全魚(yú)樣品,用于體組成的測(cè)定;每箱取 3尾魚(yú)于尾靜脈取血,置 4℃冰箱過(guò)夜,于 4℃條件下以 6 000 r/min離心 10 min,收集血清,-20℃保存?zhèn)溆?每箱取 3尾魚(yú)采用搗毀脊髓法處死,取出肝胰臟,立即放入液氮罐中速凍,然后轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱保存。肝胰臟勻漿液在 10 000×g 4℃條件下離心 30 min,取上清液作為酶活性分析樣品,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
飼料原料及魚(yú)體樣品均在 105℃烘干至恒重,然后進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定。采用凱氏定氮法測(cè)定樣品的總氮含量,將測(cè)定結(jié)果乘以 6.25即得粗蛋白質(zhì)含量,粗脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定,粗灰分含量采用高溫(550℃)灰化法測(cè)定[14]。
肝胰臟谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)以及血清過(guò)氧化氫酶(CAT)、堿性磷酸酶(AKP)和溶菌酶活性均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。GOT、GPT的活性單位定義為每毫克組織蛋白質(zhì)與基質(zhì)在 37℃下作用 60 min,生成 1μmol丙酮酸所需要的酶為 1個(gè)卡門(mén)氏單位;T-SOD、CuZn-SOD的活性單位定義為每毫克組織蛋白質(zhì)在 1 mL反應(yīng)液中超氧化物歧化酶(SOD)抑制率達(dá) 50%時(shí)所反應(yīng)的SOD量為 1個(gè)國(guó)際單位(U);CAT的活性單位定義為 25℃、p H 7.0條件下,每分鐘分解 1μmol CAT所需的酶的量為 1個(gè)國(guó)際單位;AKP的活性單位定義為 100 mL血清在 37℃與底物作用 15 min產(chǎn)生 1 mg酚所需要的酶的量為 1個(gè)金氏單位;溶菌酶的活性單位定義為每分鐘吸光值減少 0.001所需血清的量為 1個(gè)國(guó)際單位。組織中蛋白質(zhì)含量采用Bradford[15]方法測(cè)定。
表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %
特定生長(zhǎng)率(specific growth rate,SGR,%d)=100×[ln末重(g)-ln初重(g)]/試驗(yàn)天數(shù)(d);
蛋白質(zhì)效率(protein efficiency ratio,PER,%)=100×魚(yú)體增重(g)/蛋白質(zhì)攝人量(g);
飼料系數(shù)(feed conversion ratio,FCR)=總干物質(zhì)攝食量(g)/魚(yú)體總增重(g);
成活率(survival rate,SR,%)=100×終末魚(yú)尾數(shù) (只)/初始魚(yú)尾數(shù)(只)。
數(shù)據(jù)均以平均值表示,采用 SPSS 11.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),若差異達(dá)到顯著,則進(jìn)行 Tukey多重比較,顯著性水平為 P<0.05。
由表 2可知,飼料中補(bǔ)充不同來(lái)源的微量元素Fe、Zn、Mn、Cu后,羅非魚(yú)的末重 、SGR均顯著升高(P<0.05),同時(shí)有機(jī)組和有機(jī)組合體組羅非魚(yú)的末重、SGR均顯著高于無(wú)機(jī)組(P<0.05)。各組羅非魚(yú)的 PER表現(xiàn)出與 SGR相同的趨勢(shì)。此外,有機(jī)組羅非魚(yú)的末重、PER均顯著高于有機(jī)組合體組(P<0.05)。羅非魚(yú)的 FCR與 PER表現(xiàn)出相反的趨勢(shì),即對(duì)照組 >無(wú)機(jī)組 >有機(jī)組合體組 >有機(jī)組,各組間差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。試驗(yàn)期間,各組羅非魚(yú)的成活率均為 100%。
表2 不同來(lái)源微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu對(duì)羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of different sources of iron,zinc,manganese and copper on growth performance of tilapia
由表 3可知,不同來(lái)源微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)體干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量以及肥滿度的影響均無(wú)顯著差異(P>0.05)。
表3 不同來(lái)源微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu對(duì)羅非魚(yú)體組成的影響Table 3 Effects of different sources of iron,zinc,manganese and copper on body composition of tilapia %
由表 4可知,飼料中補(bǔ)充不同來(lái)源的微量元素Fe、Zn、Mn、Cu后,羅非魚(yú)肝胰臟 GPT和 GOT活性顯著升高(P<0.05)。羅非魚(yú)肝胰臟 GPT活性表現(xiàn)為:對(duì)照組 <無(wú)機(jī)組 <有機(jī)組合體組 <有機(jī)組,各組間差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。各組羅非魚(yú)的 GOT表現(xiàn)出與 GPT相同的趨勢(shì),但有機(jī)組合體組與有機(jī)組間差異不顯著(P>0.05)。
表4 不同來(lái)源微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu對(duì)羅非魚(yú)肝胰臟代謝酶活性的影響Table 4 Effects of different sources of iron,zinc,manganese and copper on the metabolic enzyme activities in hepatopancreas of tilapia 卡門(mén)氏單位/mg
由表 5可知,飼料中補(bǔ)充微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu后,羅非魚(yú)肝胰臟 T-SOD、CuZn-SOD和血清的CAT、AKP、溶菌酶活性均顯著升高(P<0.05)。有機(jī)組羅非魚(yú)肝胰臟 T-SOD活性最高,其次是有機(jī)組合體組,隨后是無(wú)機(jī)組,對(duì)照組最差。羅非魚(yú)肝胰臟CuZn-SOD活性以有機(jī)組合體組最高,其次是有機(jī)組,隨后是無(wú)機(jī)組,對(duì)照組最差。羅非魚(yú)血清 CAT活性表現(xiàn)為:對(duì)照組 <無(wú)機(jī)組 <有機(jī)組合體組 <有機(jī)組,各組間差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。有機(jī)組合體組與有機(jī)組羅非魚(yú)血清 AKP和溶菌酶活性均顯著高于無(wú)機(jī)組和對(duì)照組(P<0.05),但無(wú)機(jī)組與對(duì)照組間以及有機(jī)組合體組與有機(jī)組間均差異不顯著(P>0.05)。
本試驗(yàn)結(jié)果表明,氨基酸微量元素能夠顯著改善羅非魚(yú)的生長(zhǎng),是羅非魚(yú)飼料中最有效的微量元素補(bǔ)充形式,這與在虹鱒、斑點(diǎn)叉尾鮰上的研究結(jié)果一致[12-13,16]。眾所周知,微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu是人類(lèi)和動(dòng)物生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)素。Zn缺乏明顯抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子 -Ⅰ(IGF-Ⅰ)、受體生長(zhǎng)激素和生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白 mRNA的表達(dá)[17-18]。像IGF-Ⅰ一樣,Zn能夠促進(jìn)骨膠原蛋白的合成,繼而刺激骨骼的生長(zhǎng)[19-20]。補(bǔ) Zn能顯著提高 IGF-Ⅰ基因表達(dá)水平,與 ZnSO4相比,蛋氨酸鋅更大幅度地提高 IGF-Ⅰ mRNA表達(dá),從而有效地促進(jìn)小鼠生長(zhǎng)[21]。本試驗(yàn)中氨基酸微量元素的供給量?jī)H為無(wú)機(jī)鹽微量元素的 50%,卻能夠顯著促進(jìn)羅非魚(yú)的生長(zhǎng)。Paripatananont等[12]的試驗(yàn)也證明,當(dāng)用蛋氨酸鋅代替 ZnSO4時(shí),可使斑點(diǎn)叉尾鮰飼料中 Zn的需要量減少 70%。微量元素螯合物中的金屬離子在配位體(如氨基酸)的保護(hù)下,可有效地抵御與其他離子生成難溶的無(wú)機(jī)鹽,緩解礦物質(zhì)間的拮抗競(jìng)爭(zhēng)作用,從而減少了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失,增強(qiáng)了其吸收利用的程度。此外,氨基酸微量元素既是機(jī)體吸收金屬離子的主要形式,又是動(dòng)物體內(nèi)合成蛋白質(zhì)過(guò)程中的中間物質(zhì),所以氨基酸微量元素不僅吸收快,而且可以節(jié)省許多生化過(guò)程,節(jié)約體能消耗[22],這些因素致使氨基酸微量元素比無(wú)機(jī)微量元素具有更高的生物學(xué)效價(jià)。在其他動(dòng)物如豬[23]、雞[24-25]、山羊[11]、鮑魚(yú)[26]上也有類(lèi)似的研究報(bào)道。
以天然飼料來(lái)構(gòu)成動(dòng)物飼料往往缺乏 1種或數(shù)種微量元素,需要在飼料中額外添加。本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼料中補(bǔ)充微量元素后羅非魚(yú)的生長(zhǎng)性能得到顯著的改善。這說(shuō)明羅非魚(yú)飼料中補(bǔ)充微量元素是非常必要的。微量元素生物利用率的研究多集中在無(wú)機(jī)微量元素方面,而有關(guān)有機(jī)微量元素或飼料中微量元素生物利用率的研究報(bào)道則較少。本試驗(yàn)中,氨基酸微量元素的添加量?jī)H為無(wú)機(jī)微量元素的50%,卻能顯著提高羅非魚(yú)的生長(zhǎng),說(shuō)明有機(jī)微量元素的利用率高于無(wú)機(jī)微量元素。再者,有機(jī)微量元素產(chǎn)品價(jià)格較高,而且對(duì)這類(lèi)有機(jī)產(chǎn)品的化學(xué)特性還缺乏一種行之有效的檢測(cè)方法,如產(chǎn)品螯合率的定量測(cè)定,這些因素限制了其研究和應(yīng)用。因此,無(wú)論從提高魚(yú)類(lèi)生產(chǎn)的效益,還是從環(huán)境保護(hù)角度來(lái)講,以氨基酸(肽)微量元素作為水產(chǎn)動(dòng)物飼料添加劑,具有廣闊的應(yīng)用前景,深入研究適合動(dòng)物機(jī)體的最佳螯合物結(jié)構(gòu)形式、最佳添加比例以及氨基酸(肽)微量元素的作用機(jī)制也是非常迫切的。
表5 微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu對(duì)羅非魚(yú)非特異性免疫指標(biāo)的影響Table 5 Effects of different sources of iron,zinc,manganese and copper on non-specific immune indices in tilapia
目前,氨基酸微量元素的研究?jī)H局限在單一氨基酸的單一微量元素螯合物方面[12-13]。本試驗(yàn)探討了復(fù)合氨基酸微量元素 (Fe、Zn、Mn、Cu)對(duì)羅非魚(yú)生長(zhǎng)的影響,國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)這方面的研究報(bào)道。結(jié)果表明,羅非魚(yú)的生長(zhǎng)效果得到顯著改善。一方面可能是復(fù)合氨基酸微量元素減輕或避免了微量元素間拮抗競(jìng)爭(zhēng)作用,并且氨基酸(肽)的微量元素螯合物具有類(lèi)似二肽的結(jié)構(gòu),又消減了氨基酸吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的競(jìng)爭(zhēng);另一方面位于五元或六元環(huán)螯合物中心的金屬可以通過(guò)小腸絨毛刷狀緣,以氨基酸或肽的形式被吸收,從而使微量元素吸收和利用效率提高[27]。本試驗(yàn)中,氨基酸微量元素組合體的作用效果雖優(yōu)于無(wú)機(jī)微量元素,但要低于單一氨基酸微量元素的同時(shí)添加,這還需要從組合比例、配位體以及螯合強(qiáng)度等方面深入研究。
轉(zhuǎn)氨酶與動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝密切相關(guān),通常被認(rèn)為是肝臟功能正常與否的標(biāo)志,當(dāng)肝臟細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)受損時(shí),GOT和 GPT釋放進(jìn)入血液造成血液轉(zhuǎn)氨酶活性升高。本試驗(yàn)中,有機(jī)組羅非魚(yú)肝胰臟蛋白質(zhì)代謝酶 GOT和 GPT活性最高,有機(jī)組合體組次之,無(wú)機(jī)組再次之,對(duì)照組最低,表明飼料中蛋白質(zhì)的利用受到影響,PER的變化趨勢(shì)也進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)看法。這在一定程度上是因?yàn)楦我扰K受到損傷的緣故所致,說(shuō)明不同來(lái)源的微量元素對(duì)肝胰臟的影響程度是不同的。
氨基酸微量元素由于其特殊的結(jié)構(gòu),較好的化學(xué)穩(wěn)定性,能夠減少吸收過(guò)程中自由基的形成,增強(qiáng)殺菌能力,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力,提高抗病及抗應(yīng)激能力,從而提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能[28]。魚(yú)體內(nèi)有天然的抗氧化系統(tǒng)去除自由基,以維持正常的生理功能,其中包括 CAT、SOD等抗氧化酶[29],這 2種酶的測(cè)定常用于間接反映體內(nèi)自由基反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化及組織損傷情況,而 Zn、Mn、Cu是 SOD的組成成分,Fe作為 CAT的輔助因子,是保持其活性所不可缺少的。AKP的活性可以作為預(yù)測(cè)臨床疾病診斷及環(huán)境污染程度的重要指標(biāo),在機(jī)體的防御中起著重要作用,Zn是 AKP的重要組成部分。溶菌酶是魚(yú)體內(nèi)重要的非特異性免疫因子,是魚(yú)體生理防御水平的重要標(biāo)志,其活性受遺傳、溫度、食性等諸多因素的影響。本試驗(yàn)中添加不同來(lái)源的微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu后,不同程度提高了魚(yú)體營(yíng)養(yǎng)水平,進(jìn)而提高了羅非魚(yú)血清的溶菌酶活性。因此,微量元素對(duì)于機(jī)體的防御系統(tǒng)是相當(dāng)重要的。本研究表明氨基酸微量元素顯著提高了羅非魚(yú)的非特異性免疫力,證實(shí)了Tan等[26]關(guān)于氨基酸螯合態(tài)微量元素可提高魚(yú)體抗病力的判斷。Paripatananont等[12]的研究也表明,蛋氨酸鋅替代硫酸鋅后可提高斑點(diǎn)叉尾鮰經(jīng) Edwardsiella ictaluri攻毒后的存活率。Dudley-Cash[30]報(bào)道,給肉雞補(bǔ)充蛋氨酸錳和蛋氨酸鋅可減少肉雞球蟲(chóng)病的發(fā)生,降低因球蟲(chóng)病所致的死亡率。這些研究表明,飼料中不同來(lái)源的微量元素能夠顯著影響?zhàn)B殖動(dòng)物的免疫系統(tǒng),從而使其免疫應(yīng)答反應(yīng)出現(xiàn)差異。由此可見(jiàn),氨基酸微量元素對(duì)于維持動(dòng)物機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)和提高抗病力是不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素添加劑。
①羅非魚(yú)飼料中適當(dāng)添加微量元素是必要的,但不同形態(tài)的微量元素的促生長(zhǎng)效果也不盡相同。
②氨基酸微量元素比無(wú)機(jī)微量元素能更有效地促進(jìn)羅非魚(yú)的生長(zhǎng),降低飼料系數(shù)。
③氨基酸微量元素能夠顯著提高羅非魚(yú)的非特異性免疫力,可以廣泛應(yīng)用于羅非魚(yú)的養(yǎng)殖生產(chǎn)。
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動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)2011年5期