劉彩娟 孫滿吉＊ 孫金艷 呂文龍 劉 薇 單安山 張永根

飼用微生物(direct-fed microbial,DFM)即傳統(tǒng)所說的益生菌,它是指給動物添加的天然存在的活體微生物[1],不僅對動物體腸道微生物有促進(jìn)作用,還對其它部位(如反芻動物瘤胃)和動物周邊微生物環(huán)境有改善作用[2]。飼用微生物不僅能改變瘤胃發(fā)酵模式,還能提高動物的生產(chǎn)性能[3]。研究報道,反芻動物飼糧中添加飼用微生物能改變瘤胃與后段消化道的微生物數(shù)量及瘤胃發(fā)酵模式,提高飼料的降解率,促進(jìn)纖維的降解[3-5],增進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的外流速度,提高飼料采食速率,提高產(chǎn)奶量,改善奶成分[1-6],增進(jìn)機(jī)體健康,提高抗氧化能力[7]。國內(nèi)外有關(guān)直接飼喂益生菌在奶牛上的研究已取得了初步成績,但復(fù)合益生菌對瘤胃發(fā)酵作用機(jī)制以及對纖維素酶活的影響還不清楚,目前我國在該領(lǐng)域的研究多集中在單菌的機(jī)理研究以及復(fù)合益生菌對生產(chǎn)效益的影響方面。因此,本文旨在通過研究飼糧中添加復(fù)合益生菌對奶牛瘤胃發(fā)酵及纖維素酶活的影響,探討復(fù)合益生菌影響瘤胃調(diào)控的作用機(jī)制,為復(fù)合益生菌提高產(chǎn)奶量的作用機(jī)理以及其作為綠色飼料添加劑的安全性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗飼料與試驗設(shè)計

復(fù)合益生菌由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所提供,活菌數(shù)為 1.2×109cfu/mL。復(fù)合益生菌組成為:乳酸桿菌 41.5%、酵母菌 36.6%、鏈球菌21.2%、光合作用菌 0.5%、放線菌 0.2%。

試驗選用 3頭體重約為 550 kg,安裝有永久性三位點(diǎn)瘤胃瘺管的泌乳中期健康荷斯坦奶牛。試驗分 3組,分別為對照組、低劑量組和高劑量組,各組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加 0、0.6×1011和1.2×1011cfu/d的復(fù)合益生菌,采用 3×3拉丁方試驗設(shè)計,試驗分為 3期,每期 18 d(預(yù)試期 15 d,正試期 3 d)。試驗于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實習(xí)基地進(jìn)行。奶牛飼糧營養(yǎng)需要參照 2004版《奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》,飼糧精粗比控制在 50∶50,基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表 1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet(air-dry basis) %

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗牛拴系飼養(yǎng),每天 08:00和 20:00分 2次飼喂,先粗后精,自由飲水。將菌液均勻噴灑在精料上面,混勻飼喂。每天觀察記錄牛只采食情況。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測定

分別取飼喂后 0、2、4、6、8 h取瘤胃液 50 mL,4層紗布過濾,取過濾后瘤胃液 2 mL裝于 2個帶蓋的小瓶中,加入 1 mL 10%三氯乙酸、1 mL 25%的偏磷酸和 2滴飽和氯化汞,立即放入 -20℃冰箱中保存,用于測定氨態(tài)氮(NH3-N)和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度。其余瘤胃液冷凍保存,用于測定菌體蛋白濃度和酶活。

1.3.1 瘤胃液 pH的測定

取出瘤胃液后,用 Mettle MP120型酸度計立即測定 pH。

1.3.2 瘤胃液 NH3-N和 VFA濃度的測定

瘤胃液 NH3-N濃度采用靛酚比色法[4]測定。

瘤胃液 VFA濃度的測定:將冷凍保存的樣品放在 4℃的冰箱中解凍,4 000 r/min離心 15 min,取上清液用巴豆酸作為內(nèi)標(biāo)物用 GC-9A型氣相色譜儀測定乙酸、丙酸、丁酸濃度以及總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度。

1.3.3 瘤胃液菌體蛋白(bacterial protein,BCP)濃度的測定

參考姜艷美等[4]測定方法,略有改動。具體操作如下:過濾后的瘤胃液,經(jīng) 4 000 r/min離心15 min,收集上清液于 20 000 r/min離心 20 min,小心無損失的收集沉淀后,用 FOSS(型號:2300)全自動凱氏定氮儀測定。

1.3.4 酶活測定

采用 3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)[5],酶活單位(IU)的定義為每分鐘每毫升酶液作用于底物生成的還原糖量(μmol)。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用 Excel 2003軟件進(jìn)行整理,運(yùn)用 SAS 8.2軟件包中的平衡試驗設(shè)計方差分析過程(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計分析,結(jié)果以平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,均值的多重比較采用 Duncan氏法進(jìn)行,P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)合益生菌對奶牛瘤胃液 p H的影響

由表 2可見,奶牛飼糧中添加不同劑量的復(fù)合益生菌對奶牛瘤胃平均 pH有顯著的影響(P＜0.05),添加復(fù)合益生菌后,與對照組(6.36)相比,低劑量組(6.43)和高劑量組(6.53)瘤胃平均 p H分別提高了 0.07和 0.17。各組 pH的變化趨勢一致,均在飼喂后迅速下降,在 4 h后降低到最低點(diǎn),而后緩慢上升,到飼喂 8 h后 pH基本接近飼喂前水平,在整個試驗期內(nèi),各組瘤胃平均 pH均維持在 6.19～6.78范圍內(nèi)。

2.2 復(fù)合益生菌對奶牛瘤胃液 NH 3-N濃度的影響

由表 2可見,各組 NH3-N濃度的動態(tài)變化是飼喂 2 h后達(dá)到最高值,隨著時間的延長,NH3-N濃度逐漸下降。從 5個時間點(diǎn)的平均值來看,低劑量組和高劑量組與對照組相比均差異顯著(P＜0.05),高劑量組的 NH3-N濃度在飼喂 2 h后各時間點(diǎn)均顯著高于對照組(P＜0.05),低劑量組在飼喂 8 h后顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.3 復(fù)合益生菌對奶牛瘤胃液 TVFA濃度的影響

由表 2可知,隨著復(fù)合益生菌添加劑量的增加,瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的 TVFA增加,高劑量組的平均值與對照組相比差異顯著(P＜0.05),低劑量組雖有提高的趨勢,但差異不顯著(P＞0.05)。由TVFA的數(shù)據(jù)可以看出,TVFA濃度在飼喂后逐漸升高,在飼喂 4 h后達(dá)到最大值,隨后逐漸下降,低劑量組和高劑量組的 TVFA濃度飼喂 2 h后各時間點(diǎn)有高于對照組趨勢,但差異不顯著(P＞0.05)。低劑量組和高劑量組的乙酸濃度平均值顯著高于對照組(P＜0.05),而各組丙酸濃度、丁酸濃度和乙酸/丙酸比值無顯著差異(P＞0.05)。

2.4 復(fù)合益生菌對奶牛瘤胃液 BCP濃度的影響

由表 2可見,高劑量組的 BCP濃度平均值較對照組顯著增加(P＜0.05),而低劑量組和對照組沒有顯著差異(P＞0.05),BCP濃度動態(tài)變化趨勢顯示,隨時間的延長,低劑量組和高劑量組的BCP濃度均呈現(xiàn)增加的趨勢,且高劑量組在飼喂4 h后顯著高于對照組,各組均在飼喂 8 h后達(dá)到最大值。

2.5 復(fù)合益生菌對奶牛瘤胃纖維素酶活的影響

由表 3可見,飼糧中添加復(fù)合益生菌組的羧甲基纖維素酶、水楊苷酶和木聚糖酶 3種酶活比對照組相比顯著提高(P＜0.05),其中高劑量組木聚糖酶活提高最為明顯。高劑量組的微晶纖維素酶活性顯著高于對照組(P＜0.05),而低劑量組的微晶纖維素酶活性與對照組相比無顯著變化(P＞0.05)。

3 討 論

瘤胃 pH是評價瘤胃發(fā)酵狀況的基本指標(biāo),它主要受唾液、飼糧及其降解物的堿化和緩沖的影響,一般認(rèn)為當(dāng)瘤胃 pH＜6.2時微生物蛋白質(zhì)合成效率下降[8],盧德勛[9]認(rèn)為促進(jìn)纖維素消化的適宜瘤胃液 p H范圍為 6.0～6.8,低于 6.2時,纖維分解菌生長就會受到抑制。本試驗?zāi)膛ｏ曃购? h內(nèi)瘤胃 pH變化為 6.19～6.78,而且低劑量組和高劑量組 p H在飼喂后 6 h顯著高于對照組,說明復(fù)合益生菌能穩(wěn)定瘤胃 p H,促進(jìn)瘤胃微生物在良好的瘤胃環(huán)境下迅速繁殖,從而加速纖維素的消化。

瘤胃 NH3-N是一個動態(tài)平衡過程,反映了特定飼糧組成條件下蛋白質(zhì)降解與微生物蛋白質(zhì)合成的動態(tài)平衡關(guān)系。一方面飼料被瘤胃微生物分解產(chǎn)生 NH3-N;另一方面瘤胃中的微生物利用飼料降解的 NH3-N與酮酸合成微生物蛋白質(zhì)。NH3-N是瘤胃內(nèi)合成菌體蛋白的主要前體物質(zhì),瘤胃中 NH3-N濃度過高或過低都不利于微生物的生長繁殖,因此保持瘤胃液中的最適 NH3-N濃度是保證微生物蛋白合成的首要條件[10]。本試驗中隨著復(fù)合益生菌劑量的增加,NH3-N濃度也不斷上升,并且在飼喂 8 h后達(dá)到顯著水平。這與大多數(shù)試驗結(jié)果類似,Ghorbani等[11]直接飼喂丙酸桿菌與對照組相比,瘤胃 NH3-N濃度顯著上升。有研究報道認(rèn)為 NH3-N濃度對微生物生長的臨界量為 6～30 mg/dL[10-12],本試驗 NH3-N濃度均在此范圍內(nèi)。

瘤胃 VFA的組成比例是衡量瘤胃發(fā)酵能力的直接指標(biāo)。瘤胃 VFA的產(chǎn)量主要來自進(jìn)入瘤胃的飼料碳水化合物的發(fā)酵,是奶牛重要的能源物質(zhì),為瘤胃微生物的合成提供能量[13]。乙酸是泌乳反芻動物乳腺合成乳脂中脂肪酸的重要底物[12]。本試驗使用復(fù)合益生菌后,TVFA的濃度和乙酸濃度顯著上升,表明瘤胃產(chǎn) VFA的微生物類群數(shù)量或者代謝能力提高,促進(jìn)了碳水化合物的降解,使得瘤胃內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化。乙酸濃度提高可以解釋奶牛產(chǎn)奶量增加和乳脂率提高的原因;另一方面,乙酸/丙酸較對照稍有升高但差異不顯著,也從側(cè)面說明乙酸產(chǎn)生菌受到刺激效應(yīng)可能大于丙酸產(chǎn)生菌。

瘤胃微生物可以利用飼料蛋白降解產(chǎn)生的NH3-N、氨基酸和肽類合成微生物蛋白質(zhì)。

表2 復(fù)合益生菌對奶牛瘤胃發(fā)酵的影響Table 2 Effects of compound probiotics supplementation on ruminal fermentation of dairy cows

續(xù)表2

表3 復(fù)合益生菌對奶牛瘤胃纖維分解相關(guān)酶活性的影響Table 3 Effects of compound probiotics supplementation on activities of cellulase of dairy cows IU

姜艷美等[4]認(rèn)為,釀酒酵母菌培養(yǎng)物添加量為 5%時顯著增加了瘤胃微生物蛋白質(zhì)濃度。本試驗結(jié)果顯示,高劑量組較其他組相比可以顯著增加瘤胃微生物蛋白質(zhì)的濃度,值得注意的是,該組 NH3-N濃度也最高,與通常認(rèn)為的 NH3-N濃度較高時,細(xì)菌濃度較高相符合。原因可能是由于高劑量復(fù)合益生菌促進(jìn)瘤胃微生物利用 NH3-N合成更多的菌體蛋白,也可能是由于復(fù)合益生菌自身的添加而提高了瘤胃液中總微生物蛋白質(zhì)濃度。但從不同采樣時間點(diǎn)看,低劑量組和高劑量組中 NH3-N濃度均高于對照組,且相對應(yīng)時間點(diǎn)的菌體蛋白濃度也較高。這說明瘤胃液中菌體蛋白濃度升高大部分是來源于復(fù)合益生菌刺激了瘤胃部分微生物生長繁殖,從而間接提高了菌體蛋白濃度。有關(guān)具體是哪一種益生菌發(fā)揮的作用,還有待進(jìn)行更深一步的研究。

本研究所分析的羧甲基維素酶代表的是一類能夠隨機(jī)切斷纖維素非結(jié)晶區(qū)的葡聚糖鏈內(nèi)β-1,4糖苷鍵的內(nèi)切葡聚糖酶;水楊苷酶代表的是能夠切開纖維二糖的 β-1,4糖苷鍵的纖維二糖苷酶;木聚糖酶代表的是一組能夠水解木聚糖底物生成木糖的酶類,包括內(nèi)切 β-1,4木聚糖酶、外切 β-1,4木聚糖酶和 β-木糖苷酶等多組分在內(nèi)的多酶復(fù)合體;微晶纖維素酶是能夠協(xié)同水解結(jié)晶纖維素底物產(chǎn)生葡萄糖的多酶組分復(fù)合體,反映了包括內(nèi)切、外切葡聚糖酶和纖維二糖苷酶等多種酶活性,是代表纖維酶解全程總效應(yīng)的一項指標(biāo)[5]。瘤胃中纖維降解細(xì)菌及非纖維降解菌以及瘤胃真菌都能產(chǎn)生高活性的木聚糖酶,本試驗高劑量組顯著提高了木聚糖酶活,并且高劑量組瘤胃 pH穩(wěn)定在適宜范圍內(nèi),瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)物 TVFA濃度及乙酸濃度提高,瘤胃纖維降解細(xì)菌和真菌生長所需的 NH3-N濃度及菌體蛋白濃度相應(yīng)提高說明高劑量復(fù)合益生菌能較好促進(jìn)瘤胃微生物生長并提高植物半纖維素降解率。纖維素的降解需要一系列酶的協(xié)同作用,本研究結(jié)果表明,高劑量組的羧甲基纖維素酶、水楊苷酶和微晶纖維素酶活顯著提高,這意味著添加高劑量復(fù)合益生菌,可加快飼料纖維易降解成分的消化速度,提高纖維的起始消化率;同時降解纖維素結(jié)構(gòu)致密區(qū)和其他組分的相關(guān)酶活提高,說明適宜水平的復(fù)合益生菌能在一定程度上消除對纖維總消化率的限制影響,提高瘤胃纖維物質(zhì)的降解程度,從而改變纖維成分在全消化道中的消化率。馮偉業(yè)等[14]和黃慶生等[5]的試驗結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。

4 結(jié) 論

①添加復(fù)合益生菌可顯著提高瘤胃 p H,對瘤胃內(nèi)環(huán)境無任何不良影響。

②高劑量的復(fù)合益生菌添加組可顯著增加瘤胃 TVFA和乙酸濃度,但對丙酸、丁酸、以及乙酸/丙酸比值沒有顯著影響。

③添加復(fù)合益生菌可顯著提高 NH3-N濃度,高劑量組顯著增加了瘤胃液 BCP的濃度。

④添加高劑量復(fù)合益生菌可顯著提高羧甲基纖維素酶活、水楊苷酶活、木聚糖酶活及微晶纖維素酶活。

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