鄭愛(ài)娟 劉國(guó)華 董曉玲 李 勇 陳桂蘭

小肽是氨基酸吸收的主要形式，飼糧中的大部分氨基酸是以小肽的形式通過(guò)依賴(lài)于H+的Ⅰ型小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(PepT1)在小腸內(nèi)被吸收。研究表明，動(dòng)物小腸(或腸細(xì)胞)對(duì)肽的吸收受飼糧和營(yíng)養(yǎng)［1-6］、饑餓［7-9］、腸道損傷［10-11］、燒傷［12］、缺氧［13］、晝夜變化［14］等多種因素的影響，其中大部分因素是通過(guò)影響PepT1 mRNA表達(dá)而起作用。至今尚未詳細(xì)了解其作用途徑，但鑒于多種激素和活性因子都在物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著配體(第一信使)作用，因此研究激素和活性因子對(duì)PepT1 mRNA表達(dá)的影響將有助于揭示肽轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控的生理和生化機(jī)制。目前已經(jīng)報(bào)道了胰島素［15-17］、生長(zhǎng)激素［12-13］、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)［15，18］、腎上腺素受體激動(dòng)劑［19］、瘦素［20］和三碘甲狀腺原氨酸(T3)［21］對(duì)肽轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，并對(duì)肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步探討。但現(xiàn)有的研究報(bào)道大部分是以哺乳動(dòng)物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為模型，而以禽類(lèi)為動(dòng)物模型的研究尚不多見(jiàn)。本試驗(yàn)擬通過(guò)研究甲狀腺素、胰高血糖素(pancreas glucagon，PG)和EGF對(duì)肉雞小腸PepT1 mRNA表達(dá)的影響，為探討肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步揭示肉雞對(duì)小肽的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

左旋甲狀腺素鈉(T4，天津赫素制藥有限公司)、PG(Sigma Aldrich公司)、EGF(Sigma Aldrich公司)、甲巰咪唑(methimazole，北京雙橋制藥公司)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

選用50只1日齡健康雄性肉仔雞，按常規(guī)飼養(yǎng)管理至25日齡，為預(yù)試期。期間自由采食玉米-豆粕型飼糧，自由飲水，24 h光照。1日齡注射接種馬立克氏疫苗，7日齡滴鼻接種新城疫弱毒-腎傳支二聯(lián)疫苗。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

預(yù)試期后，從上述肉雞中選擇體重?zé)o差異的25日齡雄性肉仔雞30只，分為5組，每組6只雞，分別接受不同激素處理，每天1次，連續(xù)5 d。對(duì)照組、EGF組、PG組分別皮下注射蒸餾水0.20 mL/kg、EGF 0.03 mg/kg、PG 0.10 mg/kg;T4組、TH 組分別灌服 T4330.00 μg/kg、甲巰咪唑(抗甲狀腺藥物)25.00 mg/kg，同時(shí)皮下注射蒸餾水 0.20 mL/kg。

T4參照大鼠甲亢模型［22］的劑量給藥，PG參照大鼠外源PG試驗(yàn)?zāi)Ｐ停?3］的劑量給藥，EGF參照多器官功能障礙綜合征(MODS)小鼠模型治療有效劑量［24］給藥，甲巰咪唑參照甲狀腺功能減退癥大鼠模型［25］的劑量給藥。

試驗(yàn)雞接受最后1次處理12 h后采血，制備血清;乙醚麻醉后宰殺，取十二指腸、空腸、回腸中段各1 cm，用冷生理鹽水沖洗腸段后液氮速凍，放入超低溫冰箱保存待測(cè)。

1.4 指標(biāo)及測(cè)定方法

1.4.1 血清 T3、人表皮生長(zhǎng)因子(h-EGF)和 PG含量測(cè)定

血清T3、h-EGF和PG含量分別采用T3放免試劑盒(HY-03)、h-EGF放免試劑盒(HY-058)和PG放免試劑盒(HY-039)測(cè)定。試劑盒均為北京華英生物技術(shù)研究所產(chǎn)品。計(jì)數(shù)器采用GC-911型γ放免計(jì)數(shù)器(中國(guó)科大光電儀器中佳分公司)。

1.4.2 小腸PepT1 mRNA表達(dá)量測(cè)定

采用離心柱型總RNA提取試劑盒(RNAultra，北京天為時(shí)代科技有限公司產(chǎn)品)提取腸組織總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。參考 PepT1基因［AY029615(2 914 bp)］序列設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物為:5'-TAGACTGGGCAAGCGTCTT-3'，下游引物為:5'-TTTGCAACGACGACGAGAA-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為347 bp;內(nèi)參基因β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)上游引物為:5'-TGAACAAGCCCAGAGGTTT-3'，下游引物為:5'-ATCTAAGAACGGATACCTCAGG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為649 bp。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

使用PCR儀(Gene Amp PCR system 9700型，美國(guó)Applied Biosystem公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:cDNA模板和Taq DNA聚合酶各1μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L)4 μL，MgSO4(100 mmol/L)0.25 μL，上 下 游 引 物(10μmol/L)各1μL，加無(wú)菌蒸餾水至50μL。

擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，29 個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。溴化乙錠染色，電泳儀(DYY-Ⅲ31A型，北京市六一儀器廠(chǎng))電泳，紫外凝膠分析儀拍照，采用Bio-1D++(法國(guó)Vilber Lourmat公司)軟件分析結(jié)果，計(jì)算PepT1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

采用Statistica 6.0統(tǒng)計(jì)軟件One-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，F(xiàn)isher’s LSD法多重比較，以 P＜0.05、P ＜0.01分別作為差異顯著和極顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 雞血清 h-EGF、T 3、PG 含量

由表1可知，連續(xù)5 d皮下注射EGF和PG對(duì)血清中h-EGF和PG含量無(wú)顯著影響(P＞0.05);口服T4顯著提高血清T3含量(P＜0.05)，口服甲巰咪唑則顯著降低血清T3含量(P＜0.05)。

2.2 雞小腸Pep T1 mRNA表達(dá)量

由圖1和表2可知，不同激素處理對(duì)雞小腸PepT1 mRNA表達(dá)量有顯著影響(P＜0.05)。皮下注射PG(P ＜0.05)和口服T4(P ＜0.01)均顯著提高了雞小腸各腸段PepT1 mRNA表達(dá)量平均值，表明二者對(duì)雞小腸PepT1 mRNA表達(dá)有上調(diào)作用，其中以T4的上調(diào)作用更為明顯。皮下注射EGF和口服甲巰咪唑有降低PepT1 mRNA表達(dá)量的趨勢(shì)，但均未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)。

3 討論

3.1 甲狀腺素對(duì)雞小腸Pep T1 mRNA表達(dá)的調(diào)控

甲狀腺素的主要功能是維持動(dòng)物正常生長(zhǎng)發(fā)育、保持正常體溫和能量代謝，其生理功能主要是通過(guò)與細(xì)胞核受體結(jié)合、加速mRNA形成并促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。已知?jiǎng)游锛?xì)胞內(nèi)存在著一類(lèi)DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)型受體系統(tǒng)，該類(lèi)受體與甲狀腺素和類(lèi)固醇激素結(jié)合，激活mRNA的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。Matosin-Matekalo等［26］報(bào)道，T3處理的Caco-2/TC7克隆細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收提高了10倍，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SGLT1)mRNA表達(dá)量也隨T3劑量的提高而提高，Na+，K+-ATP酶含量也有明顯增加。另有研究同樣發(fā)現(xiàn)，T3處理也以劑量依賴(lài)的方式提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT5)mRNA表達(dá)量［27］。關(guān)于甲狀腺素對(duì)PepT1 mRNA表達(dá)影響機(jī)制的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

表1 EGF、PG和T 4對(duì)雞血清相應(yīng)激素含量的影響Table 1 Effects of EGF，PG and T4 on contents of according hormones in serum of broilers

圖1 雞小腸Pep T1和β－肌動(dòng)蛋白基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of the RT-PCR products of PepT1 andβ-actin gene in small intestine of broilers

本次試驗(yàn)中連續(xù)5 d口服T4顯著提高血清T3水平，并在轉(zhuǎn)錄水平上顯著上調(diào)了PepT1 mRNA表達(dá);而連續(xù)5 d口服甲狀腺抑制劑則顯著降低血清T3水平，PepT1 mRNA表達(dá)略低于對(duì)照組;表明T3水平與PepT1 mRNA表達(dá)之間存在一定的劑量依賴(lài)關(guān)系。這些結(jié)果表明，DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)型受體系統(tǒng)可能是調(diào)控肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)信號(hào)過(guò)膜傳導(dǎo)的途徑之一。但據(jù)Ashida等［21］報(bào)道，T3處理在促進(jìn)甲酰葡萄糖苷和蘇氨酸吸收的同時(shí)，卻抑制了Caco-2細(xì)胞對(duì)甘氨酰肌氨酸(Gly-Sar)的吸收，并降低了PepT1 mRNA表達(dá)量和PepT1蛋白含量，與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能與哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)以及體組織和離體培養(yǎng)細(xì)胞之間的差異有關(guān)。

3.2 EGF對(duì)雞小腸Pep T1 mRNA表達(dá)的調(diào)控

EGF是一類(lèi)重要的生長(zhǎng)因子，它是由50～60個(gè)氨基酸分子組成的多肽類(lèi)活性物質(zhì)。其主要功能是促進(jìn)間質(zhì)及上皮細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖，在體內(nèi)介導(dǎo)上皮生長(zhǎng)，促進(jìn)血管形成，抑制胃酸分泌，加速傷口愈合等。近年來(lái)研究表明，EGF在腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收方面也發(fā)揮著重要作用。

EGF具有調(diào)控肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的作用。Nielsen等［18］報(bào)道，EGF長(zhǎng)期(26～28 d)培養(yǎng) Caco-2 細(xì)胞使其Gly-Sar轉(zhuǎn)運(yùn)量降低約50%，轉(zhuǎn)運(yùn)最大速率降低90%，同時(shí)PepT1 mRNA表達(dá)量和細(xì)胞膜PepT1蛋白含量都明顯降低，表明EGF是通過(guò)下調(diào)PepT1 mRNA表達(dá)降低細(xì)胞二肽轉(zhuǎn)運(yùn)能力的。另外，Nielsen等［15］發(fā)現(xiàn) EGF 短期(5 min)刺激即能增加Caco-2細(xì)胞攝取Gly-Ser的能力，并于10～20 min后達(dá)到平臺(tái)期，轉(zhuǎn)運(yùn)最大速率提高了約50%，但并未影響PepT1 mRNA表達(dá)量和H+濃度，同時(shí)其促轉(zhuǎn)運(yùn)作用未受蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(brefeldin A)的影響，表明 EGF處理不會(huì)影響PepT1蛋白的合成。

表2 EGF、PG和T 4對(duì)雞小腸PepT1 mRNA表達(dá)量的影響Table 2 Effects of EGF，PG and T4 on the expression level of PepT1 mRNA in the small intestine of broilers

本試驗(yàn)未能觀察到注射EGF對(duì)其在血清中含量和PepT1 mRNA表達(dá)量的顯著作用，可能是本試驗(yàn)所用的h-EGF與雞的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)親和力較差(人類(lèi)和雞的EGFR同源性為75%)，掩蓋了EGF的作用，也有可能與藥劑量較低有關(guān)。但PepT1 mRNA表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道中長(zhǎng)期效應(yīng)的研究結(jié)果一致。

3.3 PG對(duì)雞小腸Pep T1 mRNA表達(dá)的調(diào)控

PG是由胰島細(xì)胞分泌的一種多肽激素。其主要功能是促進(jìn)糖原分解和糖異生作用，使血糖升高。其作用是通過(guò)環(huán)腺苷酸-蛋白激酶A(cAMP-PKA)系統(tǒng)，激活肝細(xì)胞的磷酸化酶，加速糖原分解。此外，PG也能以腸細(xì)胞作為靶細(xì)胞，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收［28］。Thompson 等［29］在大鼠腹腔注射PG顯著增加空腸細(xì)胞刷狀緣膜電位，使葡萄糖和半乳糖的吸收提高50%以上，并可能增加纈氨酸的吸收。Debnam等［30］報(bào)道了PG可以直接作用于大鼠空腸上皮細(xì)胞，促進(jìn)刷狀緣膜微囊和基底膜微囊對(duì)半乳糖的吸收。而迄今關(guān)于PG與肽轉(zhuǎn)運(yùn)之間的聯(lián)系仍未見(jiàn)研究報(bào)道。此外，現(xiàn)有報(bào)道中也未發(fā)現(xiàn)PG對(duì)營(yíng)養(yǎng)吸收相關(guān)基因表達(dá)的影響。

本試驗(yàn)中，注射PG并未顯著影響其在血清中含量，可能與PG極短的半衰期(5～10 min)有關(guān)。但每天1次的PG注射仍然影響了雞小腸PepT1 mRNA表達(dá)量，在轉(zhuǎn)錄水平上上調(diào)了PepT1 mRNA表達(dá)量，顯然PG具有促進(jìn)雞小肽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的潛力。但其是否確實(shí)存在該生理功能仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié)論

①口服T4、甲巰咪唑分別顯著提高、顯著降低血清T3含量。

②皮下注射PG和口服T4均顯著提高了雞小腸PepT1 mRNA表達(dá)量，而皮下注射EGF和口服甲巰咪唑?qū)ζ錈o(wú)顯著影響。

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