楊小軍 王筱霏 尹瑞卿 姚軍虎

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100)

胃腸道作為家禽一個(gè)重要組織器官既是食物消化吸收的主要場(chǎng)所，又是大多數(shù)病原侵入機(jī)體的主要門戶。集約化家禽養(yǎng)殖過程中面臨諸多的應(yīng)激因素，在采食過程中家禽腸道接觸大量的致病性抗原，腸道黏膜免疫系統(tǒng)生理功能很難在短時(shí)期內(nèi)發(fā)育完善，故常出現(xiàn)腸道炎癥性疾病;同時(shí)，隨著廣譜、高效抗生素的大量使用，腸道黏膜菌群平衡遭到破壞，使得腸道黏膜表面條件性致病菌感染顯得較為突出，如大腸桿菌腸炎。另外，自2006年歐盟全面叫停飼料用抗生素后，雞肉中抗生素殘留等問題也極大地阻礙了我國雞肉產(chǎn)品的出口。特異、高效細(xì)菌抗性物質(zhì)的研發(fā)將極大推動(dòng)我國肉雞養(yǎng)殖的高效、健康發(fā)展，提高我國畜禽產(chǎn)品的國際競(jìng)爭(zhēng)力。

多糖是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞中具有特殊活性的重要生物大分子物質(zhì)。隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)不同來源的多糖具有廣泛而復(fù)雜的生物活性，已經(jīng)引起醫(yī)藥界高度重視，并成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。功能性多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤作用、抗病毒作用、抗衰老作用、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用、對(duì)物質(zhì)代謝具有影響、抗?jié)冏饔谩㈩惸I上腺皮質(zhì)激素和促腎上腺皮質(zhì)激素作用以及對(duì)輻射損傷的保護(hù)等作用。多糖的構(gòu)效關(guān)系是指多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)與其生物活性之間的關(guān)系，化學(xué)結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，是當(dāng)今糖化學(xué)和糖生物學(xué)共同關(guān)注的焦點(diǎn)問題。

我國對(duì)多糖的研究起步比較晚，始于20世紀(jì)70年代，但近年來發(fā)展迅速，研究對(duì)象涉及真菌類、地衣類、植物、花粉和動(dòng)物等。研究的范圍包括多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)分析、理化性質(zhì)、免疫學(xué)、藥理學(xué)以及治療應(yīng)用等，對(duì)其免疫增強(qiáng)作用機(jī)制的研究已深入到分子和受體水平。研究的方法涉及化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)等諸多領(lǐng)域。我國動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)家近些年試圖從不同角度來研究控制腸道細(xì)菌性疾病，也研制出一些產(chǎn)品，如多糖、酸化劑和益生素等。但在多糖的應(yīng)用上存在很大的盲目性，在未明晰具有抗性的功效物質(zhì)及其作用機(jī)制的情況下，隨意地選擇中藥多糖進(jìn)行添加，極大地制約了多糖類抗菌物質(zhì)的應(yīng)用。本文旨在在綜述多糖的研究現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上探討多糖結(jié)構(gòu)與其免疫調(diào)節(jié)作用的構(gòu)效關(guān)系，以期為多糖飼料添加劑的合理應(yīng)用和研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 多糖研究現(xiàn)狀

目前，以多糖結(jié)構(gòu)、功能和藥用研究為核心的糖工程被認(rèn)為是繼蛋白質(zhì)工程、基因工程后生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中最具挑戰(zhàn)性的一個(gè)科學(xué)前沿，迄今已有數(shù)百種植物、微生物多糖被分離提取，研究的對(duì)象涉及真菌類、地衣類、植物以及花粉、微生物等多種來源的多糖［1－2］。多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由不同的單糖殘基在不同的連接位置以不同類型的糖苷鍵連接，形成具有不同構(gòu)象、不同相對(duì)分子質(zhì)量的多糖。多糖的結(jié)構(gòu)決定其功能，而多糖的分離純化是結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)，因此國內(nèi)外的學(xué)者在多糖的分離、純化、結(jié)構(gòu)分析、結(jié)構(gòu)修飾以及活性測(cè)定方面做了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)它們具有抗氧化、抗疲勞、降血糖、抗腫瘤、抗病毒、降血脂和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力等多方面的藥理作用，尤其是對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)［1－8］。但是因?yàn)楣δ苄远嗵穷惢衔镌谔烊划a(chǎn)物中含量低，而且分離提取困難，部分多糖的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不易控制，限制了多糖的研究，使其遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于蛋白質(zhì)和核酸的研究。目前多糖的研究仍側(cè)重于分離純化、化學(xué)組成及生物活性等方面，對(duì)多糖的空間結(jié)構(gòu)及其在體內(nèi)的作用機(jī)制等都未及深入。中國的多糖資源十分豐富，具有十分巨大的開發(fā)潛力，而且隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分離純化技術(shù)的不斷進(jìn)步，傳統(tǒng)方法與現(xiàn)代科學(xué)儀器的結(jié)合使用，多糖越來越多的性質(zhì)被人們所認(rèn)識(shí)，也逐步地應(yīng)用于臨床各種疾病的治療當(dāng)中，如用于慢性乙型遷延性肝炎及消化道腫瘤的放、化療輔助藥物香菇多糖注射液(批準(zhǔn)文號(hào):國藥準(zhǔn)字 H20030131;藥品本位碼:86904840000308;生產(chǎn)單位:金陵藥業(yè)股份有限公司福州梅峰制藥廠)，用于預(yù)防和治療慢性支氣管炎、感冒及哮喘的卡介菌多糖核酸注射液(批準(zhǔn)文號(hào):國藥準(zhǔn)字 S20020019;藥品本位碼:86904944000013;生產(chǎn)單位:湖南斯奇生物制藥有限公司)和用于治療慢性肝炎、腫瘤病的豬苓多糖注射液(批準(zhǔn)文號(hào):國藥準(zhǔn)字Z11020812;藥品本位碼:86900243000075;生產(chǎn)單位:中國中醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥廠)等(國家食品藥品監(jiān)督管理局)。因此，多糖的結(jié)構(gòu)及功能研究正在逐步地進(jìn)行中，有著廣闊的前景和研究空間。

2 多糖的免疫調(diào)控作用

大腸桿菌感染造成肉雞生長發(fā)育遲緩、生產(chǎn)性能下降、飼料報(bào)酬下降、死淘率及屠宰廢棄率增加以及藥費(fèi)增加等，給養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。大腸桿菌關(guān)鍵性致病因子脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又稱內(nèi)毒素，位于革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜中，可激活單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞合成并釋放多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)。在畜禽養(yǎng)殖中常導(dǎo)致一系列病理反應(yīng)，包括膿毒癥、膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征等。LPS進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后，刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量具有致熱效應(yīng)的炎性細(xì)胞因子，如NF-κB，引發(fā)細(xì)菌感染。LPS還會(huì)啟動(dòng)補(bǔ)體系統(tǒng)及活化T細(xì)胞，引起個(gè)體免疫系統(tǒng)的過度活化。隨著“LPS受體激活簇”理論的提出，開展LPS結(jié)構(gòu)性識(shí)別與跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞炎癥反應(yīng)構(gòu)效關(guān)系的研究將對(duì)預(yù)防畜禽養(yǎng)殖應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有很好的推動(dòng)作用。

早有研究證實(shí)，K1莢膜多糖是侵入性大腸桿菌的一種很重要的致病因素［9］。最新研究報(bào)道，革蘭氏陰性菌LPS可誘發(fā)動(dòng)物腸道、肺、心、腎和肝的炎癥反應(yīng)［10－12］。有研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)植物致病菌的胞外多糖可以通過鰲合鈣抑制非特異性免疫應(yīng)答［13］。Chang 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，鮑氏針層孔菌多糖(PBP)可以顯著增強(qiáng)LPS和伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的小鼠 B、T淋巴細(xì)胞增殖，且PBP在12.5～100.0μg/m L呈劑量依賴型抑制淋巴細(xì)胞一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，結(jié)果提示PBP可以刺激免疫活性并抑制炎癥反應(yīng)。以上表明，一些功能性多糖可能具有增強(qiáng)動(dòng)物體對(duì)致病性細(xì)菌抗性的作用。Guo等［15］研究發(fā)現(xiàn)，中草藥多糖可以增強(qiáng)感染柔嫩艾美爾球蟲肉雞的免疫反應(yīng)，減輕因感染球蟲所致的體增重下降，表明多糖對(duì)于增強(qiáng)球蟲抗性效果起到了很好的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以顯著增加肉雞ND抗體滴度和淋巴細(xì)胞增殖，改變 CD3+、CD4+和 CD8+T細(xì)胞比例，增強(qiáng)正常免疫程序下肉雞的免疫效果［16］。Xu等［17］研究發(fā)現(xiàn)，LPS可經(jīng)TLR4/PI3K途徑誘發(fā)免疫細(xì)胞分泌炎癥信號(hào)分子(高遷移率基團(tuán)box-1)。Kim等［18］發(fā)現(xiàn)松菇多糖可以促進(jìn)受LPS刺激的巨噬細(xì)胞分泌 NO，并提高 IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α基因的表達(dá)，其機(jī)制可能涉及松菇多糖的TMF-Ⅱ可以使IκB磷酸化從而活化NF-κB。酵母細(xì)胞壁多糖占細(xì)胞壁干重的90%，主要有α－D－甘露聚糖和β－D－葡聚糖，二者與免疫系統(tǒng)有明顯的互作特性，多糖的合理應(yīng)用可以調(diào)控黏膜免疫從而維護(hù)動(dòng)物健康、抵抗疾病。酵母細(xì)胞壁多糖可以減少致病菌鞭毛在腸道黏膜上皮細(xì)胞的黏附，降低致病菌毒素的危害，加快致病菌的排出［19］。由此可見，多糖可以作為一種天然生長促進(jìn)劑應(yīng)用在家禽生產(chǎn)中。

3 多糖構(gòu)效關(guān)系研究

多糖的結(jié)構(gòu)是決定其生物活性的最主要因素，而構(gòu)效關(guān)系的研究將為多糖的目的性篩選和分子修飾提供理論指導(dǎo)。分子修飾是通過化學(xué)、物理和生物學(xué)方法對(duì)高分子化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，以獲得功能、活性更強(qiáng)衍生物的方法，是通過改變多糖的空間結(jié)構(gòu)、分子量及取代基的種類、數(shù)目和位置來發(fā)揮作用的。但多糖構(gòu)效關(guān)系研究還未及深入，只能確定高級(jí)結(jié)構(gòu)比一級(jí)結(jié)構(gòu)在活性方面起更大的作用。

對(duì)于水溶性β－D－1，3－葡聚糖，只有分子量大于90 ku才能形成3股螺旋的高度有序結(jié)構(gòu)，具有3股螺旋結(jié)構(gòu)的葡聚糖大多都有多糖的免疫活性［20］。LPS可經(jīng)TLR4途徑誘發(fā)腸道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，而幽門彎曲菌LPS經(jīng)TLR2/MEK 1/2-ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn) IL-8分泌，誘發(fā)腸道疾?。?1］，表明不同細(xì)菌胞外LPS與宿主細(xì)胞的互作通路也是不一樣的，即多糖結(jié)構(gòu)決定其生物學(xué)功能。

利用核磁共振技術(shù)(NMR)對(duì)來自腸聚集性大腸桿菌522/C1菌株和大腸桿菌O/178菌株的抗原多糖結(jié)構(gòu)的比較發(fā)現(xiàn)，這2種抗原多糖具有完全相同的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元［22］。A li等［23］在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，來自腸聚集性大腸桿菌87/D2菌株和大腸桿菌O128菌株的抗原多糖含有的乙酰基具有相似的作用。通過分析來自大腸桿菌87的抗原多糖發(fā)現(xiàn)，水解產(chǎn)物包括海藻糖、葡萄糖、半乳糖、2－氨基－2－脫氧葡萄糖、2－氨基－2－脫氧半乳糖和庚糖，它們之間比率為 22∶12∶22∶4∶35∶4。Kiyohara等［24］研究認(rèn)為，黃芪多糖 β －D －1，3－半乳糖體或β－D－1，6－半乳糖基的降解將顯著降低其對(duì)腸道派伊爾氏斑淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性。提示β－D－1，3－半乳糖或β－D－1，6－半乳糖基在黃芪多糖免疫調(diào)節(jié)活性上有重要作用。在對(duì)太白茶多糖的4個(gè)組分分析中發(fā)現(xiàn)，由于其糖組成、分子量和連接方式不同而表現(xiàn)出了不同的免疫活性［25］。Telepnev 等［26］研究分析，LPS ?；?，能抑制樹突細(xì)胞TLRs受體介導(dǎo)的涉及炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路。這一試驗(yàn)驗(yàn)證了多糖結(jié)構(gòu)的改變將影響到其生物學(xué)功能。硫酸化多糖在免疫調(diào)節(jié)上反映出雙面性——抑制或促進(jìn)。硫酸化多糖可以抑制炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，表現(xiàn)在抑制補(bǔ)體活化、抑制淋巴細(xì)胞黏附或穿越內(nèi)皮細(xì)胞。相反，細(xì)菌分泌的硫酸化多糖可以激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)抗原識(shí)別和捕獲。其作用與其結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，如分子量、硫酸化位點(diǎn)的不同，尤其是硫酸化二糖程度、硫酸化位置和硫酸化結(jié)構(gòu)域，也許其是決定多糖免疫作用不同的主要原因［27］。多數(shù)革蘭氏陰性(G－)細(xì)菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、克雷伯氏菌和沙雷氏菌等都含LPS，其中O－特異的、富含甘露糖的多糖(甘露聚糖)具有一些免疫特性。LPS具有同質(zhì)甘露糖聚合物，其在激活補(bǔ)體系統(tǒng)活性上要高于異質(zhì)多糖，可以激活補(bǔ)體系統(tǒng)誘導(dǎo)非特異性免疫，但由于許多細(xì)菌有復(fù)雜的細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)，所以能夠?qū)ρa(bǔ)體系統(tǒng)產(chǎn)生良好的抗性［28］。由上述可知，多糖的結(jié)構(gòu)與其生物學(xué)功能有著密不可分的關(guān)系，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椏梢栽鰪?qiáng)其生物學(xué)功能。

4 小結(jié)

不同結(jié)構(gòu)的多糖其免疫調(diào)節(jié)活性功能不一，現(xiàn)仍普遍缺乏具體核心寡糖片段與腸道上皮細(xì)胞或腸道淋巴細(xì)胞分子靶標(biāo)的點(diǎn)對(duì)應(yīng)的構(gòu)效關(guān)系研究。針對(duì)現(xiàn)有研究現(xiàn)狀和本課題組工作基礎(chǔ)，筆者認(rèn)為分析功能性多糖的定植位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)，比對(duì)分析不同多糖與LPS的分子結(jié)構(gòu)和作用的分子靶標(biāo)，構(gòu)建多糖與分子靶標(biāo)的構(gòu)效關(guān)系及其下游信號(hào)通路，將為具有家禽腸道免疫功能調(diào)控作用的多糖的目的性篩選、定向分子修飾及抗生素替代品的開發(fā)研究提供理論支持。

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