楊 靜，王 維，沈恩旭，馬興麗，王朋明

(天津市西青醫(yī)院，天津300380)

血管性癡呆(VD)是癡呆中最為常見的類型之一，血管性癡呆是一種隱匿發(fā)病的、逐漸進展的記憶及認知障礙的疾病，僅僅次于阿爾茲海默病(AD)。血管性癡呆是由于慢性腦供血不足所致，當大腦血流及營養(yǎng)的供應被阻斷數(shù)分鐘，腦細胞就會出現(xiàn)壞死，從而導致腦皮層的損傷，繼而引起學習、記憶及語言的障礙。根據(jù)個人情況不同，以及中風的嚴重程度的不同，血管性癡呆可以逐漸發(fā)生，也可以突然發(fā)生。

到目前為止還沒有FDA批準的用于治療血管性癡呆的藥物。對于血管性癡呆的神經(jīng)干細胞治療受到高度關注。干細胞的研究是一個快速發(fā)展的領域。因為干細胞可以分化為神經(jīng)元從而修復腦損傷［1］。本文采用集落細胞刺激因子(G-CSF)治療VD模型大鼠，研究其對VD大鼠認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠:本實驗用成年雄性健康Wistar大鼠。體重200～250 g，購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。

1.2 實驗分組:將20只Wistar只大鼠隨機分為兩組，雙側頸總動脈永久結扎(VD)組，VD集落細胞刺激因子治療組(VD+GSF)，每組10只大鼠。

1.3 VD大鼠模型制作:采用持久性雙側頸總動脈結扎法(2VO)建立血管性癡呆的老年大鼠模型。10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，頸部皮膚剃毛備皮，碘伏消毒后沿頸部中線切開約1.5 cm的皮膚切口，找到并游離雙側頸總動脈，同時結扎。70%酒精消毒后縫合傷口，大鼠放回籠中飼養(yǎng)。

1.4 藥物給予:VD治療組給予G-CSF干預，具體過程為術后2 h給予G-CSF 200 ug/kg皮下注射，之后每d 1次，共5 d。

1.5 Morris水迷宮(MWM)測試。

1.6 抗Nestin免疫組織化學染色:兔抗大鼠一抗(抗nestin抗體，1∶100)、二抗均購于武漢博士德。

1.7 統(tǒng)計學分析:三組間比較采用SPSS 16.0軟件，單因素方差分析及選擇多重比較分析。有統(tǒng)計學意義設在P＜0.05。

2 結果

2.1 VD模型大鼠認知功能的改善:Morris水迷宮實驗中，VD模型大鼠給予集落細胞刺激因子治療后，與模型組大鼠相比，VD治療組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05，圖1)，而游泳速度并沒有改變(P＞0.05)。在第六天的測試階段，VD治療組大鼠的目標象限百分比明顯高于VD模型組大鼠(P＜0.05，圖2)。而游泳速度在兩組組間并無明顯差異(P＞0.05)。

圖1 Morris水迷宮定位巡航實驗

VD治療組大鼠的逃避潛伏期明顯低于VD模型組大鼠，兩組比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

VD治療組大鼠的目標象限百分比較VD模型組大鼠增加，兩組比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 Nestin免疫組織化學染色:我們使用Nestin抗體觀察了大鼠海馬齒狀回區(qū)Nestin的表達情況。兩組大鼠的齒狀回區(qū)的顆粒細胞都有Nestin陽性表達，分布于胞體中。VD治療組大鼠Nestin陽性表達多余VD大鼠的陽性表達。

圖2 Morris水迷宮空間搜索實驗

3 討論

水迷宮實驗表明，三組大鼠無論在定位航行階段還是在空間探索階段游泳速度都沒有顯著性差異，因此可以得出用該方法建立的VD動物模型，沒有明顯的運動障礙，有利于長時間觀察和研究。不論在學習階段還是在記憶維持階段，Morris水迷宮實驗證實，大鼠的學習記憶能力有明顯下降。血管性癡呆是由于慢性腦供血不足所致，常常由中風或者腔隙性梗塞所致［2］。血管性癡呆是一種隱匿發(fā)病的，逐漸進展的記憶及認知障礙的疾病。根據(jù)個人情況不同，以及中風的嚴重程度的不同，血管性癡呆可以逐漸發(fā)生，也可以突然發(fā)生。對于血管性癡呆的治療以預防為主，以及擴血管，血管內膜旋切等改善血管供血的對癥治療。到目前為止還沒有確切的用于治療血管性癡呆的藥物。

粒集落細胞刺激因子(G-CSF)是一種造血生長因子，是一種分子量為19.6 kDa的糖蛋白，G-CSF和其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)都有表達，在中風的動物模型中表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用。目前被認為是一種有希望的治療急性中風的藥物。VD常常由中風或者腔隙性梗塞所致，因此本研究觀察了其對于VD的保護作用。研究表明，VD大鼠和假手術組大鼠相比，認知功能下降，當給予集落細胞刺激因子治療后，與未給予治療的VD組大鼠相比，認知功能得到明顯改善。這說明粒集落細胞刺激因子參與了損傷腦組織的修復過程或替代了壞死神經(jīng)細胞的功能。

對于血管性癡呆的神經(jīng)干細胞治療受到高度關注。G-CSF的神經(jīng)保護作用與其促進成人神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化有關［3］。對于干細胞的研究是一個快速發(fā)展的領域。因為干細胞可以分化為神經(jīng)元從而修復腦損傷。因而改善腦功能提高認知水平在成年大鼠的腦區(qū)有三個部位干細胞存在，即腦室周圍、嗅球以及海馬齒狀回［4］。本研究觀察了給予集落細胞刺激因子治療VD后的Nestin的表達情況。我們的實驗結果標明在VD治療組大鼠的齒狀回區(qū)Nestin的表達多于VD模型組大鼠。Nestin是一種中間絲蛋白，是未分化的神經(jīng)干細胞的標志［5］，Nestin的高表達標明集落細胞刺激因子可能通過增加神經(jīng)干細胞的動員，分化為神經(jīng)元從而發(fā)揮損傷腦組織的修復過程或替代了壞死神經(jīng)細胞的功能。

集落細胞刺激因子是一種臨床使用安全的藥物，本實驗中表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用，并且可能與干細胞的動員有關，本研究為其臨床使用提供了良好的實驗依據(jù)。

［1］ Kalladka D，Muir KW.Stem cell therapy in stroke:Designing clinical trials.Neurochem Int，2011.

［2］ Sharp SI，Aarsland D，Day S，et al.Hypertension is a potential risk factor for vascular dementia:systematic review［J］.Int J Geriatr Psychiatry，2011，26(7):661-669.

［3］ Schneider A，Kuhn HG，Schabitz WR.A role for G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor)in the central nervous system［J］.Cell Cycle，2005，4(12):1753-1757.

［4］ Scharfman HE，Hen R.Neuroscience.Is moreneurogenesis always better?Science，2007，315(5810):336-338.

［5］ Wurdak H，Zhu S，Min KH，et al.A small molecule accelerates neuronal differentiation in the adult rat［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(38):16542-16547.