楊思遠(yuǎn),劉 琳,伍長學(xué),胡選義△

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心臟外科,貴州貴陽550004;2.貴州省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,貴州貴陽550002; 3.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸心外科,四川瀘州646000)

成體間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)皮誘導(dǎo)方法的改進(jìn)＊

楊思遠(yuǎn)1,劉 琳2,伍長學(xué)3,胡選義1△

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心臟外科,貴州貴陽550004;2.貴州省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,貴州貴陽550002; 3.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸心外科,四川瀘州646000)

目的對現(xiàn)有成體間充質(zhì)干細(xì)胞(M SCs)內(nèi)皮分化誘導(dǎo)方法進(jìn)行改進(jìn),以期找到更方便、更價(jià)廉并具有優(yōu)良誘導(dǎo)效果的誘導(dǎo)方法。方法取生長良好的P3代M SCs,分為3組。誘導(dǎo)1組:以含10%胎牛血清(FCS)、10μg/L血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、4μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的低糖DM EM培養(yǎng)基進(jìn)行內(nèi)皮誘導(dǎo)14 d;誘導(dǎo)2組:以含10%FCS、20μg/L VEGF、4μg/L bFGF的低糖DM EM培養(yǎng)基進(jìn)行內(nèi)皮誘導(dǎo)14 d;對照組:以含10%FCS低糖DM EM培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d,均于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及排列方式變化,免疫組化檢測Ⅷ因子相關(guān)抗原表達(dá),免疫熒光檢測CD31表達(dá),透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果培養(yǎng)14 d后,誘導(dǎo)1、2組細(xì)胞均變?yōu)楸馄綘?呈“鋪路石”樣排列,Ⅷ因子相關(guān)抗原及CD31均高度表達(dá),陽性率均大于90%,透射電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有W-P小體形成。而對照組細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)此類改變。結(jié)論聯(lián)合使用低濃度VEGF及bFGF可使成體MSCs獲得內(nèi)皮系細(xì)胞的特征,是一種方便、價(jià)廉、有效的誘導(dǎo)方法。

間質(zhì)干細(xì)胞;內(nèi)皮細(xì)胞;誘導(dǎo)分化;方法

由干細(xì)胞介導(dǎo)的治療性血管新生(therapeutic angiogenesis)已經(jīng)成為臨床上治療缺血性心臟疾病新的方法,很多種類的胚胎干細(xì)胞及成體干細(xì)胞得到了廣泛應(yīng)用。其中成體間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)引起眾多學(xué)者的關(guān)注,自1966年MSCs被發(fā)現(xiàn)以來[1],多年研究表明其具有自我復(fù)制,多系分化,高度增殖潛力,可分化為骨、軟骨、脂肪、韌帶等多種間葉組織,進(jìn)行相應(yīng)組織修復(fù)[2]。近來的研究進(jìn)一步表明在血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial grow th factor, VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast grow th factor,bFGF)、胰島素樣生長因子(insulin-like grow th factor, IGF-1)等誘導(dǎo)因子存在的條件下,體外培養(yǎng)的M SCs也能被誘導(dǎo)成為內(nèi)皮譜系細(xì)胞[3]。因此,MSCs勢必在治療性血管新生中扮演重要的角色。同時(shí)又因?yàn)镸SCs具有便于獲得、易于體外大量擴(kuò)增、生物學(xué)性質(zhì)保持穩(wěn)定等特點(diǎn),必將成為未來缺血性心臟病細(xì)胞治療和心血管組織工程的重要種子細(xì)胞之一。

將M SCs成功誘導(dǎo)成為內(nèi)皮細(xì)胞,是臨床醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織工程學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域研究的前提,而已有的誘導(dǎo)方法存在費(fèi)用高昂、實(shí)驗(yàn)條件要求高、誘導(dǎo)效果不盡如人意等問題,難以滿足科研及臨床需要。所以,找到一種更低廉、更方便、更有效的內(nèi)皮誘導(dǎo)方法,是科研人員迫切需要解決的問題。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠(清潔級(jí),由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,雌性,體質(zhì)量約150 g)、胎牛血清(FCS,Gibco公司)、低糖DM EM培養(yǎng)基(Gibco公司)、重組VEGF(R&D公司)、bFGF(invitrogen公司)、FITC小鼠抗大鼠CD31單克隆抗體(Serotec公司)、兔抗大鼠Ⅷ因子相關(guān)抗原(facto rⅧrelated antigen)多克隆抗體、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)等。

1.2 骨髓MSCs的培養(yǎng)及其表面抗原檢測 本研究采用梯度離心法加貼壁篩選法獲取MSCs。取SD大鼠,用頸椎脫臼法處死后,于無菌條件下分離股、脛骨,剪開骨端,暴露骨髓腔。用無血清低糖DMEM培養(yǎng)液沖出骨髓,離心后棄上清液,以無菌PBS液稀釋。取離心管,分別加入等量Percoll分離液(ρ =1.073kg/L)和骨髓稀釋液,3000r/min離心30min,仔細(xì)吸取白色單核細(xì)胞層至另一離心管,以無菌PBS液洗滌2次后,用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基(pH=7.2～7.4)重懸,并調(diào)整細(xì)胞濃度至4×105/mL,接種于250mL培養(yǎng)瓶,放入37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱靜置培養(yǎng)。7d后全量換液,以后3d換液1次。至14～16d時(shí),將融合生長約80%的細(xì)胞以0.25%胰酶-0.02%EDTA消化,按1∶3比例傳代。定期取生長狀態(tài)細(xì)胞進(jìn)行倒置相差顯微鏡觀察。待生長約80%融合時(shí)可繼續(xù)傳代。并按照文獻(xiàn)[4]的方法,進(jìn)行MSCs的表面抗原檢測。

1.3 MSCs的內(nèi)皮誘導(dǎo)分化 將生長狀態(tài)良好的P3代大鼠MSCs以0.25%胰酶-0.02%EDTA消化后,按2.5×105/mL密度接種于120mL培養(yǎng)瓶中,并分為誘導(dǎo)1組、誘導(dǎo)2組及對照組。誘導(dǎo)1組換入含10%FCS、10μg/LVEGF、4μg/LbFGF的低糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行內(nèi)皮誘導(dǎo)分化;誘導(dǎo)2組換入含10%FCS、20μg/LVEGF、4μg/LbFGF的低糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行內(nèi)皮誘導(dǎo)分化;對照組換入含10%FCS低糖DMEM培養(yǎng)基。3組均放入37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱靜置培養(yǎng),2 d換液1次,并定期于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況及形態(tài)變化。

1.4 誘導(dǎo)后細(xì)胞的內(nèi)皮特性鑒定 3組細(xì)胞培養(yǎng)14d后,均于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及排列方式變化;免疫組化檢測Ⅷ因子相關(guān)抗原表達(dá)情況;免疫熒光檢測CD31表達(dá)情況,并計(jì)算各自表達(dá)陽性率;采用透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠MSCs形態(tài)學(xué)變化 原代培養(yǎng)MSCs3d后可見細(xì)胞貼壁,5d后出現(xiàn)細(xì)胞集落,細(xì)胞大小均一,呈長梭形或多角型;10d后細(xì)胞基本達(dá)到90%以上融合,緊密排列成柵欄狀,柵欄中心呈多層分布,細(xì)胞界限欠清。傳代后細(xì)胞生長速度明顯加快,多于接種后4～6d即長滿瓶底。同時(shí)細(xì)胞體積增大,形態(tài)多表現(xiàn)為長梭形或多角形。細(xì)胞不再以集落方式生長,而是均勻分布。

2.2 各組細(xì)胞形態(tài)變化 誘導(dǎo)1、2組細(xì)胞于接種后4h均開始貼壁生長,24h后大部分細(xì)胞貼壁、分散生長,呈現(xiàn)為類三角形或不規(guī)則長梭形,此后胞體逐漸開始擴(kuò)展并伸出偽足。誘導(dǎo)3～5d后,貼壁細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán),梭形細(xì)胞從細(xì)胞團(tuán)的邊緣出芽長出,細(xì)胞團(tuán)中央為圓形細(xì)胞,形成“血島”樣結(jié)構(gòu)(封2圖1)。誘導(dǎo)14d后,兩組細(xì)胞個(gè)體逐漸變大,細(xì)胞形態(tài)由長梭形變?yōu)楸馄蕉嘟切?并呈“鋪路石”樣排列(封2圖2),具有典型內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)。而對照組細(xì)胞一直為長梭形或多角形,并呈旋渦狀排列。

2.3 各組細(xì)胞的內(nèi)皮特性檢測 誘導(dǎo)1、2組Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化檢測為陽性,其表達(dá)陽性率大于92%(封2圖3); CD31免疫熒光檢測為陽性,表達(dá)陽性率大于95%(封2圖4);透射電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有Weibel-Palade小體(W-P小體)(封2圖5)。提示誘導(dǎo)組細(xì)胞獲得了內(nèi)皮系細(xì)胞特性。而對照組細(xì)胞形態(tài)仍以長棱形為主,Ⅷ因子相關(guān)抗原及CD31檢測為陰性;透射電鏡未發(fā)現(xiàn)W-P小體(結(jié)果未顯示)。

3 討 論

本研究結(jié)果表明,聯(lián)合使用不同濃度的VEGF及bFGF均能夠在體外將來源于成年大鼠骨髓MSCs誘導(dǎo)為內(nèi)皮譜系細(xì)胞。誘導(dǎo)后細(xì)胞大小均一,外型為扁平狀,并呈“鋪路石”樣排列;表達(dá)CD31、Ⅷ因子相關(guān)抗原等內(nèi)皮細(xì)胞特異抗原;透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)W-P小體。且低濃度VEGF及bFGF的誘導(dǎo)效果與高濃度VEGF及bFGF相比,并未顯示出明顯差異。

近年來采用連續(xù)基因表達(dá)分析(serial analysisofgene expression,SAGE)及RT-PCR技術(shù)已經(jīng)證明單細(xì)胞克隆來源的MSCs能表達(dá)多種細(xì)胞系基因,其中包括內(nèi)皮及表皮特異性分子[5-6]。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示中胚層來源的MSCs在體內(nèi)外的分化潛能不僅僅局限于中胚層細(xì)胞系,還能跨胚層分化為其他細(xì)胞系。Silva等[7]將帶有標(biāo)記物的、體外分離培養(yǎng)的MSCs注射到慢性缺血?jiǎng)游锬Ｐ腕w內(nèi),觀察30d后發(fā)現(xiàn),缺血區(qū)域中毛細(xì)血管密度增加,且在增加的血管管壁中發(fā)現(xiàn)帶標(biāo)記物細(xì)胞,故認(rèn)為植入的MSCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞(ECs),介導(dǎo)了缺血區(qū)域的血管新生。但這樣的體內(nèi)研究存在著植入細(xì)胞被血管壁局部炎細(xì)胞吞噬的可能,并不能很好地證明MSCs確實(shí)分化為ECs。所以,越來越多的研究采用體外誘導(dǎo)方式。

MSCs內(nèi)皮分化的機(jī)制和誘導(dǎo)條件目前尚未得到徹底闡明。但大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為,其與MSCs所處微環(huán)境密切相關(guān)。所以在干細(xì)胞內(nèi)皮分化的眾多體外研究中,多種細(xì)胞因子被用來刺激細(xì)胞的增殖與分化,其中常用的有VEGF、bFGF、IGF-1等[8-11]。VEGF具有強(qiáng)烈的內(nèi)皮誘導(dǎo)分化作用,單用高濃度(50ng/mL)VEGF誘導(dǎo)成人MSCs7d后,即發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)vwF、KDR及FLT-1等內(nèi)皮特異性抗原,但并不表達(dá)CD31;同時(shí)細(xì)胞形態(tài)無明顯變化,仍多為長梭形或多角形,但誘導(dǎo)后細(xì)胞具有能在培養(yǎng)基中形成網(wǎng)狀微血管結(jié)構(gòu)的能力[12]。作者在前期試驗(yàn)中采用25ng/mLVEGF誘導(dǎo)MSCs,約10d后,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后細(xì)胞能表達(dá)vwF,而細(xì)胞形態(tài)及排列方式未見明顯改變,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。但該研究過程中VEGF消耗量巨大,實(shí)驗(yàn)花費(fèi)高。這些缺點(diǎn)限制了單用VEGF誘導(dǎo)方法的廣泛應(yīng)用。為節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本,作者繼續(xù)在前期實(shí)驗(yàn)中逐步減少VEGF濃度,發(fā)現(xiàn)在較低VEGF濃度條件下,只需適當(dāng)延長誘導(dǎo)時(shí)間,同樣能夠使誘導(dǎo)后細(xì)胞獲得部分內(nèi)皮特性,表達(dá)部分內(nèi)皮特異性標(biāo)志物。

而bFGF對血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等均具有很強(qiáng)的促細(xì)胞分裂增殖活性,并具有明顯的促有絲分裂作用,也是形態(tài)發(fā)生和分化的誘導(dǎo)因子之一[13]。故本研究在誘導(dǎo)方法上進(jìn)行了改進(jìn)并獲得良好效果,嘗試不同濃度VEGF(10、20 μg/L)與4μg/LbFGF聯(lián)合使用的誘導(dǎo)效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)14d誘導(dǎo)后,兩種濃度VEGF均成功將MSCs誘導(dǎo)為內(nèi)皮譜系,所得細(xì)胞具有典型ECs形態(tài)、排列方式及超微結(jié)構(gòu),并表達(dá)CD31及Ⅷ因子相關(guān)抗原。經(jīng)過具體實(shí)踐,總結(jié)如下經(jīng)驗(yàn):(1)誘導(dǎo)因子的選擇,將VEGF及bFGF聯(lián)合使用,VEGF及bFGF均對內(nèi)皮系具有強(qiáng)大的促增殖功能,且二者聯(lián)合使用具有協(xié)同效應(yīng)[14],其增殖效果大大加強(qiáng)。另外,分離純化的骨髓MSCs不可避免地受到淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等污染,聯(lián)合使用VEGF及bFGF能促進(jìn)內(nèi)皮系細(xì)胞的生長和優(yōu)化,使內(nèi)皮系相對于其他細(xì)胞具有生長優(yōu)勢,從而進(jìn)一步得到富集[15]。(2)誘導(dǎo)因子濃度的選取,根據(jù)作者前期研究結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,將VEGF濃度調(diào)整到10、20μg/L,將bFGF濃度調(diào)整到4μg/L(均較文獻(xiàn)報(bào)道低),兩種濃度均能獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。較低的VEGF濃度可以大量減少貴重誘導(dǎo)因子的用量,從而節(jié)約研究成本。(3)誘導(dǎo)時(shí)間的確定,14d左右。一般來說,在誘導(dǎo)的第10天開始,個(gè)別細(xì)胞形態(tài)即開始改變,細(xì)胞數(shù)量不斷增加,彼此接觸形成小片細(xì)胞集落。到14d時(shí),誘導(dǎo)細(xì)胞獲得很好的形態(tài)均一性。此后細(xì)胞形態(tài)變化不再明顯。同時(shí)內(nèi)皮特異性標(biāo)志物檢測也說明14d時(shí),誘導(dǎo)細(xì)胞已經(jīng)獲得內(nèi)皮特性,繼續(xù)誘導(dǎo)已無意義。本研究發(fā)現(xiàn)兩種濃度誘導(dǎo)所得細(xì)胞形態(tài)均一,Ⅷ因子相關(guān)抗原及CD31陽性,其表達(dá)陽性率均大于90%,說明通過聯(lián)合使用較低濃度的VEGF及bFGF進(jìn)行誘導(dǎo),能獲得純度較高的內(nèi)皮樣細(xì)胞,具有較高的誘導(dǎo)效率。

在MSCs定向內(nèi)皮分化過程的3～5d中,誘導(dǎo)組細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán),梭形細(xì)胞從細(xì)胞團(tuán)的邊緣出芽長出,而細(xì)胞團(tuán)中央為圓形細(xì)胞,構(gòu)成了類似胚胎血管生成過程中“血島樣”結(jié)構(gòu)[16],而在對照組培養(yǎng)體系中未觀察到該結(jié)構(gòu)。這一發(fā)現(xiàn)提示在VEGF及bFGF存在的環(huán)境中,MSCs啟動(dòng)了向ECs分化的過程,獲得了內(nèi)皮系細(xì)胞的某些生物學(xué)特性。另外,為最大限度避免培養(yǎng)體系中雜細(xì)胞所造成的檢測誤差,本研究在誘導(dǎo)14d后同時(shí)檢測兩種內(nèi)皮特異性標(biāo)志物——Ⅷ因子相關(guān)抗原及CD31,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組細(xì)胞均高度表達(dá)上述兩種特異性標(biāo)志物。而多個(gè)標(biāo)記物的同時(shí)出現(xiàn)也是干細(xì)胞內(nèi)皮分化中一個(gè)必然過程[17],這也從另一角度證實(shí)了MSCs的內(nèi)皮分化過程。本研究通過形態(tài)學(xué)、細(xì)胞免疫熒光、細(xì)胞免疫組化及透射電子顯微鏡等方法,證實(shí)經(jīng)過誘導(dǎo)的細(xì)胞具有明顯ECs特征。

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A modified method of endothelial differentiation from adult mesenchymal stem cells＊

Yang Siyuan1,L iu L in2,Wu Changxue3,Hu Xuanyi1△?
(1.Department of Cardiac Surgery,the Affiliated Hospital,Guiyang Medical College,Guiyang,Guizhou 550004,China; 2.Department of Respiratory medicine,the Peop le′s Hospital of Guizhou Province,Guiyang,550002,China;3.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery,the Affiliated Hospital,Luzhou Medical College,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveTo obtain a better,cheaper and more convenient method of endothelial differentiation from adult mesenchymal stem cells,improvement was carried out.MethodsP3 MSCs were divided into 3 groups,study group 1,study group 2 and control group.in study group 1,DM EM culture medium including 10%FCS,10μg/L VEGF,4μg/L bFGF were app lied to induce MSCs to endothelial cells for 14 days.10%FCS,20μg/L VEGF,4μg/L bFGF were used in study group 2.DM EM culturemedium were used for 14 days in control group.Changes of morphology and alignment of 2 groups were observed periodically,Ⅷfacto r and CD31 were examed by immunohistochemistry and immunofluorescence respectively,and transmission electron microscope was applied to observe intracellular ultra microstructures of 2 groups.ResultsAfter 14 days inducement,the cells of study group turned into flat shape,and arranged in a“cobble stone”manner.Ⅷfacto r and CD31 were both positive,the positive rates＞90%.And Weibel-Palade body were found in induced cells.ConclusionAdult MSCs can be induced to endothelial lineage cells by the way in vitro,which is effective,cheaper and mo re convenient.

mesenchymal stem cells;endothelial cells;induced differentiation;method

2010-09-02

2010-11-29)

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.11.004

A

1671-8348(2011)11-1049-03

貴州省科技教育人才省長專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(200891)?！? class="emphasis_bold">通訊作者,T

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