倪 錦綜述,古妙寧審校

（1.廣東省廣州市兒童醫(yī)院麻醉科 510120；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院麻醉科,廣東廣州510515）

不同的麻醉藥物組合用于小兒麻醉幾十年卻沒有對藥物接觸和可能的毒性作用進(jìn)行過系統(tǒng)評價。近年來,已建立在體和體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠碓u價多種麻醉藥物不同劑量和接觸時間相關(guān)的神經(jīng)毒性,以及基因表達(dá)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究、長期行為學(xué)評價等分析方法來研究麻醉藥引起非人靈長類動物和嚙齒動物細(xì)胞死亡的生物學(xué)途徑和行為學(xué)結(jié)果。

1 在體和體外非人靈長類動物和嚙齒動物模型

1.1 非人靈長類動物和嚙齒動物在體模型 非人靈長類動物的生理、藥理、代謝和生殖系統(tǒng)與人類有相似性,尤其是在妊娠期間。使得獼猴成為檢測氯胺酮潛在神經(jīng)退變作用的理想動物模型。在一項獼猴研究中[1],監(jiān)測了母體和幼仔所有重要生理變量,包括氧飽和度、呼出二氧化碳、體溫、心率、動脈血壓、血糖和紅細(xì)胞壓積,并維持在正常范圍內(nèi)。這是任何動物模型的必備條件,在靈長類動物遠(yuǎn)比嚙齒動物類更容易實(shí)現(xiàn)。因?yàn)殚L時間低血壓可導(dǎo)致大腦低灌注和缺血相關(guān)的細(xì)胞死亡,所以確保正常血壓和氧飽和度尤其重要[2]。

氯胺酮能很快通過胎盤轉(zhuǎn)運(yùn),有報道胎兒血中的濃度在母體給藥后2min內(nèi)接近母體水平[3]。靜脈給藥后氯胺酮在體內(nèi)迅速分布,隨后血漿濃度迅速下降[4]。近期有研究報道,需要維持獼猴麻醉氯胺酮濃度是10～25μ g/mL,比人類觀察到的（2～3μ g/mL）高5～10倍[1]。值得注意的是,出生后35d的獼猴氯胺酮血漿濃度最高,但與同年齡對照組相比卻沒有觀察到神經(jīng)細(xì)胞死亡的證據(jù)。出生后5d的獼猴神經(jīng)細(xì)胞死亡明顯,而平均血漿濃度卻大約是10μ g/mL,只是人類觀察到的血漿濃度的3～5倍。

靈長類對氯胺酮的神經(jīng)毒性作用的敏感期只限于快速突觸生成期,此期發(fā)生在圍產(chǎn)期間,至少占妊娠期的75%并持續(xù)到出生后早期,在出生后35d前某個時間點(diǎn)結(jié)束[1]。然而大鼠的敏感期在出生后1d開始并在大約14d后結(jié)束[5],此期是大鼠運(yùn)動和其他相關(guān)系統(tǒng)完全發(fā)育前,多個腦區(qū)廣泛突觸再塑形期。此期也是快速髓鞘形成期,此期中大多數(shù)傳出路徑已存在于其靶區(qū)域,雖然其分布和突觸靶位仍未成熟。在這些敏感階段期間,N-甲基-D-門冬氨酸（NMDA）阻滯劑（如氯胺酮）引起谷氨酸能神經(jīng)傳遞和受體表達(dá)的改變能影響神經(jīng)可塑性并導(dǎo)致神經(jīng)毒性。因此,神經(jīng)元發(fā)育異常、突觸可塑性異常和神經(jīng)退行性變被認(rèn)為是麻醉引起神經(jīng)毒性的起動或促成因素[6]。未成熟大鼠大腦對氯胺酮引起神經(jīng)細(xì)胞死亡的敏感期與獼猴大腦發(fā)育的危險期一致。妊娠122d的胎猴和出生后5d的初生猴正處于突觸生成期比處于更少的突觸生成階段的出生后35d的獼猴更敏感。雖然人類和獼猴大腦發(fā)育階段之間準(zhǔn)確相關(guān)性和（或）麻醉引起神經(jīng)損害的種屬特異性的敏感程度仍不明確,但可以肯定,人類和非人靈長類進(jìn)行此方面的配比比靈長類和嚙齒動物進(jìn)行此方面的配比問題更少些。近期研究發(fā)現(xiàn),妊娠122d的猴胎就皮質(zhì)發(fā)育而言等同于妊娠199d的人類胎兒且兩者都處于正常妊娠期的75%～80%范圍內(nèi)[7]。同樣,60日齡和7日齡大鼠的神經(jīng)生成和長期神經(jīng)認(rèn)知功能受異氟醚的影響亦有顯著差異[8]。

目前,導(dǎo)致凋亡和壞死的神經(jīng)毒性損害的分布、特性和神經(jīng)元敏感性仍不清楚,且可能取決于藥物濃度、接觸時間、所激活受體的亞型和細(xì)胞類型,以及神經(jīng)元的發(fā)育階段或成熟度等[1]。在這些因素中,濃度和接觸時間被認(rèn)為是最重要的因素。那么濃度和接觸時間如何與神經(jīng)毒性相關(guān)呢？

動物研究所使用的劑量一般不能反映兒科患者的劑量。動物研究中使用的劑量和接觸時間一般超出,甚至相當(dāng)大地超出臨床使用的劑量。而此類研究也是非常重要的,它是臨床前研究的主要組成部分,一旦確定毒性劑量和作用,就可能對更低劑量和（或）更短接觸時間進(jìn)行評價以確定無毒性作用的相關(guān)接觸水平,用以比較臨床相關(guān)劑量并確立是否存在安全范圍,該方法常用于藥物開發(fā)?？傊?不能不考慮濃度來談接觸時間,也不可能不考慮接觸時間來談濃度。

動物研究的另一個目的是確定是否存在某個麻醉時間,短于此時間,就不能檢測到明顯的氯胺酮引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡。有研究對出生后5d的獼猴氯胺酮麻醉（靜脈輸注速率為20～50mg·kg-1·h-1,以維持淺外科期麻醉）3h和24h后進(jìn)行評價。選取24h觀察相對長時間麻醉的作用,而選取3h觀察相對短時間麻醉的影響。麻醉時間為3h組不能觀察到明顯的神經(jīng)毒性作用。相反,24h組麻醉后出現(xiàn)皮質(zhì)Ⅱ、Ⅲ層Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)、銀染細(xì)胞數(shù)和Fluoro-Jade C陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加。這些數(shù)據(jù)與利用發(fā)育大鼠和出生后3d獼猴建立的原代皮質(zhì)培養(yǎng)系統(tǒng)觀察到的時程研究結(jié)果一致[6,9]。在上述時程研究中,培養(yǎng)物接觸氯胺酮2、4、6、12、24h。結(jié)果表明,加入10M氯胺酮6h時導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降約30%,接觸12～12h后下降約50%～70%。而氯胺酮接觸培養(yǎng)物2h與對照組比較無顯著不同。接觸4h后,觀察到神經(jīng)細(xì)胞死亡則輕度而不明顯增加,提示持續(xù)激活（代償性）上調(diào)后的NMDA受體超過6～24h對氯胺酮引起的獼猴額葉皮質(zhì)培養(yǎng)發(fā)育神經(jīng)元的細(xì)胞死亡極其重要[6]。氯胺酮引起的細(xì)胞死亡在體內(nèi)也呈接觸時間依賴性。近期,Zou等[10]研究則進(jìn)一步提示氯胺酮引起額葉皮質(zhì)神經(jīng)元大量死亡的時間是在接觸氯胺酮麻醉3、9h的某個時間點(diǎn)。

就麻醉藥物的濃度與神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡關(guān)系的問題，Zhang等[11]報道7日齡C57BL/6小鼠吸入1.7%亞臨床濃度的七氟醚2h即能在12h后在大腦檢測出神經(jīng)元病理性凋亡[12]。長時間（6h）接觸高濃度3%七氟醚的6日齡C57BL/6小鼠在成年后可出現(xiàn)學(xué)習(xí)缺陷和社會行為異常。

在體實(shí)驗(yàn)中,排除其他導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的因素也至關(guān)重要,研究表明,吸入0.75%異氟醚4h、1.5%異氟醚2h和2.0%異氟醚1h在血糖水平正常情況下神經(jīng)元凋亡仍顯著增加,因此在上述條件下,麻醉后引起的神經(jīng)元凋亡與血糖下降無關(guān)[13]。

1.2 嚙齒動物和非人靈長類動物體外模型 體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)方法都已用來評估各種不同藥物的多種劑量和接觸時間相關(guān)的神經(jīng)毒性。采用體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（原代培養(yǎng)[6,9,14-15]和器官類型切片培養(yǎng)[16-17]）可以與體內(nèi)研究[18,1]一起評估麻醉藥接觸對發(fā)育期非人靈長類動物和嚙齒類動物模型的影響。采用獼猴和嚙齒動物腦組織建立原代額葉皮質(zhì)培養(yǎng)和器官型切片培養(yǎng)系統(tǒng),可同時提供并行的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮诙虝r間內(nèi)用最少數(shù)量的動物協(xié)助評價多種麻醉藥、多種劑量的神經(jīng)毒性。

這些體外制備物可用于快速評價麻醉藥的神經(jīng)毒性和支持直接研究麻醉藥對大腦不同發(fā)育階段的影響。原代和器官型培養(yǎng)可維持重要解剖關(guān)系和突觸連接,并可直接評價細(xì)胞死亡,而且是不同麻醉藥神經(jīng)毒性篩選和評價的可靠模型。此外,這些制備物可直接應(yīng)用靶向特異性受體基因的反義脫氧寡核苷酸,以及直接進(jìn)行酶處理和治療藥物處理。該方法可從最少數(shù)目的研究對象收集大量研究資料,且可以用簡化的非人類靈長類和嚙齒類動物系統(tǒng)來研究與麻醉藥引起細(xì)胞損害相關(guān)的細(xì)胞機(jī)制。

2 藥物基因組學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)方法

2.1 藥物基因組學(xué)系統(tǒng)與生物學(xué)方法在mRNA和DNA水平（基因組學(xué)）的應(yīng)用

2.1.1 基因芯片 基因芯片技術(shù)已用于確定哪一些候選死亡基因可能與麻醉藥引起的凋亡相關(guān)?；蛐酒梢詭椭治雎樽硭幰鸬纳窠?jīng)毒性與基因表達(dá)改變之間的關(guān)系。因此,不同麻醉藥在不同時間點(diǎn)的基因表達(dá)譜得以比較。

2.1.2 組織（體內(nèi)和體外） 冰凍組織在低溫箱中切片以備激光俘獲顯微切割技術(shù)（laser capture microdissection,LCM）使用。簡單說,組織包埋在含有光學(xué)切割溫度復(fù)合物的模具中,該含有冰模的組織在干冰上平衡并冰凍于低溫箱切片臺上,切下來大約7～10μ m的切片并立即黏附在置于干冰之上的顯微鏡載玻片直到當(dāng)日進(jìn)行LCM處理或儲存于-80℃冰箱中日后處理。LCM維持組織冷凍能保證從收集細(xì)胞上獲取高質(zhì)量mRNA。對于每個實(shí)驗(yàn)對象收集來自相同腦區(qū)的細(xì)胞,這是屬于系統(tǒng)生物學(xué)研究的范疇。從這些細(xì)胞分離出總 RNA并用RNA擴(kuò)增生成標(biāo)記的cRNA用于基因芯片實(shí)驗(yàn)。簡單說,分離出的RNA合成雙股cDNA,之后體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA,后者又用于第2輪擴(kuò)增產(chǎn)生更多的雙股cDNA。此雙股cDNA沿菁藍(lán)3-CTP或青藍(lán)5-CTP染料擴(kuò)展而產(chǎn)生標(biāo)記反義cRNA。

2.1.3 寡核苷酸芯片（體內(nèi)和體外） 標(biāo)記RNA,與標(biāo)記參照RNA一起,共同雜交在包含超過22000個序列的大鼠寡核苷酸芯片上。掃描芯片并用ArrayTrack in-house軟件分析。

2.1.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)舉例 新生大鼠多次氯胺酮給藥產(chǎn)生神經(jīng)元凋亡[5]。為明確是否單次氯胺酮給藥也產(chǎn)生凋亡,7日齡大鼠皮下注射40mg/kg氯胺酮或注射用水,注射1、2、4h后獲取大腦組織以鑒定丘腦部是否有與急性氯胺酮接觸相關(guān)的明顯基因表達(dá)改變。LCM用來從丘腦部收集大約500個細(xì)胞,采用基因芯片流程與前述一致?；蛐酒治鲎R別出用藥1h后大腦中有18處明顯的基因表達(dá)改變（＞1.5倍的改變,P＜0.05）,用藥2h后有624處基因表達(dá)改變明顯。用藥4h后有52處基因表達(dá)改變明顯。這些表達(dá)改變的基因中,一些基因已明確與凋亡相關(guān)（cycs、ell、pdcd8、prkcb1和ripk1）,而大腦其他與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因在單次注射氯胺酮后上調(diào)。

2.2 藥物基因組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)方法在蛋白質(zhì)水平的應(yīng)用

2.2.1 蛋白質(zhì)組學(xué) 為識別與NMDA阻滯劑和γ-氨基丁酸（GABA）激動劑引起的凋亡相關(guān)的特異性蛋白質(zhì),可用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳或磷酸蛋白質(zhì)同位素編碼固相標(biāo)記的方法從組織樣本中分離蛋白質(zhì)。親和性分離后切除或消化也能用于分離特異性蛋白質(zhì)。定量和識別能通過基質(zhì)輔助激光解吸附技術(shù)和電離質(zhì)譜技術(shù)完成[1]。

2.2.2 蛋白質(zhì)免疫印跡分析法（體外和體內(nèi)） 反義寡核苷酸能用來確定NM DA受體反義寡核苷酸對麻醉藥引起神經(jīng)毒性的影響,并確定給予靶向NMDA受體NR1亞單位的反義寡核苷酸是否能阻斷穩(wěn)態(tài)蛋白水平。為明確神經(jīng)細(xì)胞黏附分子上的唾液酸聚合體（sialic acid polymer on neural cell adhesion molecules,PSA-NCAM）表達(dá)下降與氯胺酮引起皮質(zhì)神經(jīng)元或者NMDA受體阻滯（由轉(zhuǎn)移酶活性）是否相關(guān),用免疫印跡分析PSA-NCAM與NR1蛋白、肌動蛋白比和反義寡核苷酸的保護(hù)效應(yīng)[7]。同時給予NR1反義寡核苷酸幾乎能完全阻斷氯胺酮引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡。研究表明氯胺酮明顯上調(diào)NM DA受體NR1亞單位蛋白。同時給予反義寡核苷酸能防止氯胺酮引起的NR1上調(diào)和阻斷氯胺酮引起的PSA-NCAM減少。

3 結(jié)論

應(yīng)結(jié)合發(fā)育期嚙齒動物和非人靈長類動物的體內(nèi)模型和體外制備物進(jìn)行研究。這些結(jié)合的模型能從最少數(shù)量的實(shí)驗(yàn)物收集大量數(shù)據(jù),并可用簡化的非人靈長類動物或嚙齒動物模型系統(tǒng)研究麻醉藥引起與細(xì)胞死亡相關(guān)的細(xì)胞機(jī)制。

采用藥物基因組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的方法對幫助進(jìn)一步了解大腦相關(guān)的生物過程包括神經(jīng)可塑性和神經(jīng)毒性有巨大的潛力,這些方法也可用來監(jiān)測不同治療方案的療效。此外,通過使用體內(nèi)和體外非人靈長類和嚙齒動物模型,這些方法能進(jìn)一步加深對復(fù)雜生物學(xué)過程如麻醉藥引起的發(fā)育期大腦神經(jīng)細(xì)胞死亡、凋亡和（或）壞死的理解[19-20]。了解這些復(fù)雜的生物學(xué)過程將闡明麻醉藥引起大腦細(xì)胞死亡途徑,并有助于發(fā)現(xiàn)改善兒科患者麻醉藥毒性的不良后果的治療方法。

[1]Slikker W,Paule MG,Wright LKM,et al.Systems biology approaches for toxicology[J].J Appl Toxicol,2007,27（3）：201-217.

[2]Slikker W,Zou X,Hotchkiss CE,et al.Ketamine-induced neurodegeneration in the perinatal rhesus monkey[J]. Toxicol Sci,2007,98：145-158.

[3]Nayar R,Sahajanand H.Does anesthetic induction for cesarean section with a combination of ketamine and thiopentone confer any benefits over thiopentone or ketamine alone？A prospective randomized study[J].Minerva Anestesiol,2009,75（4）：185-190.

[4]Sigtermans M,Dahan A,Mooren R,et al.S（+）-ketamine effect on experimental pain and cardiac output：a population pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling study in healthyvolunteers[J].Anesthesiology,2009,111（4）：892-903.

[5]Ikonomidou C,Bosch F,Miksa M,et al.Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain[J].Science,1999,283：70-74.

[6]Wang C,Sadovova N,Hotchkiss C,et al.Blockade of N-methyl-Daspartate receptors by ketamine produces loss of postnatal day 3monkey frontal cortical neurons in culture [J].Toxicol Sci,2006,91：192-201.

[7]Clancy B,Finlay BL,Darlington RB,et al.Extrapolating brain development from experimental species to humans [J].Neurotoxicology,2007,5：931-937.

[8]Stratmann G,Sall JW,May LD,et al.Isoflurane differentially affects neurogenesis and long-term neurocognitive function in 60-day-old and 7-day-old rats[J].Anesthesiology,2009,110（4）：834-848.

[9]Wang C,Sadovova N,Fu X,et al.The role of NMDA receptors in ketamine-induced apoptosis in rat forebrain culture[J].Neuroscience,2005,132：967-977.

[10]Zou X,Patterson TA,Divine RL,et al.Prolonged exposure to ketamine increases neurodegeneration in the developing monkey brain[J].Int J Dev Neurosci,2009,27（7）：727-731.

[11]Zhang X,Xue Z,Sun A.Subclinical concentration of sevoflurane potentiates neuronal apoptosis in the developing C57BL/6mouse brain[J].Neurosci Lett,2008,447（2/3）：109-114.

[12]Satomoto M,Satoh Y,Terui K,et al.Neonatal exposure to sevoflurane induces abnormal social behaviors and deficits in fear conditioning in mice[J].Anesthesiology，2009,110（3）：628-637.

[13]Johnson SA,Young C,Olney JW.Isoflurane-induced neuroapoptosis in the developing brain of nonhypoglycemic mice[J].J Neurosurg Anesthesiol,2008,20（1）：21-28.

[14]Berns M,Zacharias R,Seeberg L,et al.Effects of sevoflurane on primary neuronal cultures of embryonic rats[J]. Eur J Anaesthesiol,2009,26（7）：597-602.

[15]Xiang Q,Tan L,Zhao YL,et al.Isoflurane enhances spontaneous Ca（2+）oscillations in developing rat hippocampal neurons in vitro[J].Acta Anaesthesiol Scand,2009,53（6）： 765-773.

[16]Wang C,AnastasioN,PopovV,et al.Blockade of N-Methyl-D-aspartate receptors by phencyclidine causes the loss of corticostriatal neurons[J].Neuroscience，2004,125：473-483.

[17]Wang C,Fridley J,Johnson KM.The role of NMDA receptor upreglation in phencyclidine-induced cortical apoptosis in organotypic culture[J].Biochem Pharmac,2005，69：1373-1383.

[18]Zou X,Sadovova N,Patterson TA,et al.The effects of L-carnitine on the combination of inhalation anestheticinduced developmental neuronal apoptosis in the rat frontal cortex[J].Neuroscience,2008,151：1053-1065.

[19]Istaphanous GK,Loepke AW.General anesthetics and the developing brain[J].Curr Opin Anaesthesiol,2009,22（3）：368-373.

[20]Brée B,Gourdin M,De Kock M.Anesthesia and cerebral apoptosis[J].Acta Anaesthesiol Belg,2008,59（3）：127-137.