宋漢君 田國(guó)忠 韓 曦 扈清云 王培軍 (佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室,黑龍江 佳木斯 154007)

慢性心力衰竭(CHF)是一種復(fù)雜的臨床綜合征,是多種心血管疾病發(fā)展的嚴(yán)重階段,且預(yù)后較差。研究表明,細(xì)胞因子的異常在 CHF的病理生理和發(fā)病機(jī)制中起重要作用〔1〕,其中內(nèi)皮素-1(ET-1)在正常情況下含量較少,在 CHF發(fā)展過(guò)程中顯著升高,且與 CHF程度密切相關(guān),并且是 CHF獨(dú)立的預(yù)后因素〔2〕。 21世紀(jì)國(guó)內(nèi)外研究者提出 “心衰生物學(xué)治療”〔3,4〕的觀點(diǎn)。近年研究表明,生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRP)對(duì)心臟有較全面的保護(hù)作用。本研究通過(guò)觀測(cè) CHF大鼠心功能、心肌細(xì)胞形態(tài)及 ET-1表達(dá)的變化,探討 GHRP的治療作用,以期為臨床治療 CHF提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康 Wistar大鼠 30只,由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 主要試劑 鹽酸阿霉素(ADR,浙江海正藥業(yè)股份有限公司);GHRP-2(上海超研生物科技有限公司);ET-1免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 隨機(jī)分為正常組、模型組和治療組,每組 10只。模型組第 2、4天腹腔注射(ip)ADR 1 mg/kg,第 6、8天 ip ADR 2 mg/kg,第 10、12天 ip ADR 3mg/kg,第 14、16天ip ADR 4mg/kg,第 17天取材。正常組 ip等體積生理鹽水;治療組 ip ADR同模型組,同時(shí)從第 10天起,每日尾靜脈注射 1次 GHRP-2 25μg/kg,第 20天取材。

1.2.2 心功能測(cè)定 ①動(dòng)物稱重后用戊巴比妥鈉 ip麻醉;②氣管插管,在大鼠頸部暴露頸部氣管,將插管插入,并接小動(dòng)物呼吸機(jī);③頸外靜脈插管,頸部游離頸外靜脈,迅速向心導(dǎo)入插管,并通過(guò)導(dǎo)管注入肝素抗凝;④頸總動(dòng)脈插管,在頸部分離頸總動(dòng)脈,迅速向心導(dǎo)入插管,經(jīng)換能器連接生理多導(dǎo)儀,描記相關(guān)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。

1.2.3 蘇木素-伊紅(HE)染色光鏡觀察 心功能測(cè)定完成后,打開(kāi)胸腔,左心室插管,沖洗,迅速取出心臟,吸去血跡,將心臟切成厚約 4～5 mm的塊狀組織后,固定。經(jīng)水洗、乙醇脫水和二甲苯透明后浸蠟,包埋,切片。二甲苯透明,乙醇脫水,水洗。染色后,經(jīng)水洗、脫水、透明,中性樹(shù)膠封固。在 400倍鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.4 免疫組織化學(xué)(IHC)法觀測(cè)心肌中 ET-1免疫陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度 按說(shuō)明書(shū)采用親合素-生物素-酶復(fù)合物法(SABC)染色。使用 BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)、分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)均

2 結(jié) 果

2.1 心功能測(cè)定 各項(xiàng)心功能指標(biāo)正常組均正常。模型組心率、動(dòng)脈壓、心臟舒張期左室內(nèi)壓最大變化速率均低于正常組,且差異顯著(P＜0.05)。治療組與正常組比較,左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dt-max)等均無(wú)顯著差異。見(jiàn)表 1。

2.2 心肌 HE染色光鏡觀察 正常組心肌結(jié)構(gòu)清晰,肌纖維連接緊密,排列整齊,細(xì)胞質(zhì)豐富均勻;模型組心肌細(xì)胞有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),受累較重的心肌細(xì)胞呈小灶狀或片狀壞死,肌纖維排列紊亂,細(xì)胞水腫,出現(xiàn)空泡樣變;治療組與正常組比較,心肌細(xì)胞變化不明顯。見(jiàn)圖 1。

2.3 心肌中 ET-1免疫陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度 各組心肌中ET-1表達(dá)的平均光密度,模型組(0.369±0.016)高于正常組(0.296±0.022)、治療組(0.310±0.020),且差異顯著(P＜0.05);而治療組與正常組比較,差異不顯著(P＞0.05)。

表1 各組大鼠心率、動(dòng)脈壓等變化(±s,n=10)

表1 各組大鼠心率、動(dòng)脈壓等變化(±s,n=10)

與正常組、治療組比較:1)P＜0.05;下表同

組別 n 心率(次/min) 動(dòng)脈壓(mmHg) +dp/dtmax(mmHg/s) -dp/dtmax(mmHg/s)正常組 10 247.3±19.28 132.1±17.43 3 224.4±278.07 2339.8±182.06模型組 10 212.6±12.851) 106.5±15.981) 2 142.2±252.091) 1 482.9±210.021)治療組 10 220.3±14.94 121.4±10.91 3 084.7±275.96 2 152.1±242.35

圖1 各組心肌HE染色結(jié)果(×400)

3 討 論

近年來(lái)隨著心血管疾病發(fā)病率的升高,CHF的出現(xiàn)也呈上升趨勢(shì)。20世紀(jì) 90年代人們才逐漸認(rèn)識(shí)到心肌重塑是心衰發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制,在這個(gè)過(guò)程中細(xì)胞因子起到重要作用。ET-1是主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞等合成及分泌的一種活性多肽,具有正性肌力作用,通過(guò)激活原癌基因刺激生長(zhǎng),使心肌細(xì)胞肥大和增殖,心肌肥厚〔5〕。國(guó)內(nèi)外研究顯示,ET-1在正常人血漿中的含量較低,但在CHF患者血漿中含量顯著升高〔6〕,與 CHF的嚴(yán)重程度密切相關(guān)〔7〕。 Margulies等〔8〕研究發(fā)現(xiàn) CHF中 ET-1是一個(gè)敏感和特異的指標(biāo)。因血漿中ET-1的來(lái)源較為廣泛,所以本實(shí)驗(yàn)通過(guò)IHC法檢測(cè)心肌中 ET-1免疫陽(yáng)性細(xì)胞的變化。結(jié)果顯示:心肌中 ET-1表達(dá)的平均光密度,模型組高于正常組、治療組。由此可見(jiàn),心肌組織中的ET-1與CHF密切相關(guān),并且參與到 CHF的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中。由于血流動(dòng)力學(xué)改變,造成血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,血管內(nèi)皮功能障礙,血管壁切應(yīng)力改變、缺血缺氧、交感神經(jīng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活和多種細(xì)胞因子的激活而導(dǎo)致 ET-1釋放增加。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示,治療組與模型組比較,動(dòng)脈壓、心臟舒張期左室內(nèi)壓最大變化速率明顯增加,與國(guó)內(nèi)外的報(bào)道一致,說(shuō)明 GHRP能夠通過(guò)調(diào)節(jié)血流動(dòng)力學(xué)來(lái)改善心功能。心肌中ET-1表達(dá)水平下降,可能的機(jī)制:①GHRP通過(guò) RAAS,降低血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)濃度,減少對(duì)心肌正常功能的損傷。②抑制 CHF大鼠應(yīng)激激素的過(guò)度反應(yīng),降低ET-1的濃度。此外曹濟(jì)民課題組研究發(fā)現(xiàn),GHRP既能增加心臟收縮,又能增加心臟的舒張,在心臟血流動(dòng)力學(xué)方面作用明顯〔9〕。因而 GHRP能夠調(diào)控ET-1對(duì)心臟的作用。

目前國(guó)內(nèi)外GHRP對(duì)CHF心臟作用的研究甚少。通過(guò)本研究顯示,GHRP能降低 ET-1的表達(dá),改善心功能,以期為 CHF生物學(xué)治療藥物的研制和開(kāi)發(fā)探索新思路,為臨床上應(yīng)用 GHRP相關(guān)藥物治療CHF提供理論依據(jù)。

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