張海濤,李鄭武,王 瑩,張秀芹,郭長虹,李會成△

(1.哈藥集團技術(shù)中心,哈爾濱 150020;2.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 150025)

RNA干擾技術(shù)給藥途徑的研究進展*

張海濤1,2,李鄭武1,王 瑩1,張秀芹1,郭長虹2,李會成1△

(1.哈藥集團技術(shù)中心,哈爾濱 150020;2.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 150025)

RNA;病毒,載體;蛋白質(zhì)類;RNAi

RNA干擾(RNAi)是序列特異性雙鏈 RNA(dsRNA)介導(dǎo)的基因沉默機制,這種機制將有希望成為治療多種疾病的有力工具。Castanotto和Rossi[1]在新桿狀線蟲中發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA有沉默基因表達的能力。Nguyne等[2]詳細闡述體外合成的小干擾RNA(siRNAs)在哺乳動物細胞中能將序列特異的基因敲除。隨著siRNAs技術(shù)在鼠丙型肝炎治療中的成功運用,生物技術(shù)領(lǐng)域的科學(xué)家們在運用siRNAs技術(shù)治療包括病毒感染、癌癥等多種疾病中做出了極大的努力。使用siRNAs治療的關(guān)鍵優(yōu)勢在于它能特異性的敲除疾病相關(guān)基因[3]。

在臨床上RNAi技術(shù)首先被應(yīng)用于治療老年性黃斑變性(AMD)和呼吸道合胞病毒(RSV)感染[4-6]。以RNAi技術(shù)為基礎(chǔ)的治療方法,還被應(yīng)用于治療病毒感染、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等疾病中,其中多數(shù)處于臨床前開發(fā)階段[7-8]。同時,以RNAi技術(shù)為基礎(chǔ)的治療也面臨許多挑戰(zhàn),需要加以解決和改進,才能實現(xiàn)其全部潛力。更詳細、深入地了解RNAi過程的基本機制,對于提高RNAi的潛力與效力都十分重要。例如,合成的siRNAs和短發(fā)夾核糖核酸(shRNAs)都具有各自的優(yōu)勢和劣勢[9-11]。這些都是在設(shè)計以 RNAi技術(shù)為基礎(chǔ)治療特定疾病時需要重點考慮的方面。此外,雖然許多研究顯示,各種RNAi技術(shù)為基礎(chǔ)的治療在體內(nèi)實驗中展現(xiàn)出了潛在的有效性,但其他的一些研究則也顯示出了其不利的一面。其不良反應(yīng)包括誘發(fā)Ⅰ型干擾素反應(yīng)和內(nèi)源性RNAi途徑中元件的過飽和,提示 RNAi投遞到靶細胞前必須謹慎設(shè)計[12-13]。

1 非病毒 RNAi投遞系統(tǒng)

在體內(nèi)細胞特異性的siRNAs投遞,是發(fā)展基于RNAi技術(shù)有效治療疾病所面臨的最重要問題。雙鏈siRNAs是一種帶負電荷的聚合物,在無載體輔助情況下,不易穿透疏水性且?guī)д姾傻募毎?。同時,未被修飾或保護的siRNAs也很快被血清中的核糖核酸酶降解。然而,穩(wěn)定的化學(xué)修飾可以延長RNAi藥物在體內(nèi)的半衰期,增強其功能。非病毒的RNAi投遞方式,包括非選擇性全身投遞和細胞特異性全身性投遞,后者可減輕藥物對非靶向性細胞的不良反應(yīng),同時減少藥物的使用量[14]。

1.1 化學(xué)修飾增加siRNAs的穩(wěn)定性 化學(xué)修飾siRNAs的2′位點(包括2′-氧-甲基嘌呤和 2′-氟尿嘧啶修飾)可以提高對血清中核糖核酸酶的抵抗能力來增加其穩(wěn)定性。2′-氧-甲基嘌呤修飾的siRNAs可以對體內(nèi)的乙肝病毒感染提供更強的保護作用[15]。基于 siRNAs雙鏈的2′-氧-甲基化修飾,使 RNAi在發(fā)揮功能潛力與保護不被降解之間找到了最佳的平衡,同時還可避免誘發(fā)體內(nèi)產(chǎn)生干擾素[16-17]。

1.2 非選擇性siRNAs全身投遞 有效的全身性siRNAs投遞方法是靜脈注射化學(xué)修飾的siRNAs,可以耦聯(lián)膽固醇基團或用保護性的脂質(zhì)體顆粒包裹。這種非選擇性系統(tǒng)投遞適用于特定的組織類型,如肝臟和小腸,但對大多數(shù)其他細胞或組織類型不適合[18-20]。膽固醇基團與 siRNAs的3′反義鏈羥基連接,促進靶向細胞受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞作用。在利用siRNAs靶向載脂蛋白B來調(diào)節(jié)膽固醇代謝的研究中,用這種方法通過全身投遞siRNAs,成功進入小鼠肝臟和腸道內(nèi)[21]。結(jié)果在肝臟中載脂蛋白B基因表達量減少50%以上,在腸道內(nèi)減少70%,同時伴隨著總膽固醇水平的降低[22]。一些研究證實,將siRNAs與特定的能促進細胞吸收的共軛分子結(jié)合,系統(tǒng)地投遞siRNAs可以到達特定組織。

將化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的siRNAs包被到脂雙層膜內(nèi),稱為穩(wěn)定的核酸雙層脂微粒(SNALPs)。SNALPs已經(jīng)實現(xiàn)了 RNAi的全身投遞,其脂雙層由陽離子和中性脂肪構(gòu)成,表層帶有具親水性的聚乙二醇(PEG)[23-24]。一個使用SNALPs系統(tǒng)性投遞siRNAs的重要研究顯示,用于治療非人類疾病時,會產(chǎn)生較高的RNAi反應(yīng)[25]。在獼猴體內(nèi),SNA LPs介導(dǎo)的siRNAs投遞能有效降低載脂蛋白B、低密度脂蛋白和膽固醇的表達水平,同時使肝內(nèi)的載脂蛋白B基因mRNA的表達維持在低于10%的水平。雖然目前還不清楚非特異性的siRNAs重復(fù)投遞到其他組織或細胞類型中是否會增加脫靶現(xiàn)象(OTEs),但SNALPs投遞方法已被證實對肝臟中靶點的治療是有效的。

肽轉(zhuǎn)導(dǎo)域蛋白(peptide transduction domain,PTD)能有效滲透進細胞膜。由于siRNAs帶有較強的負電荷,而PTD帶正電荷,他們的結(jié)合體不能有效進入細胞,所以簡單地將siRNAs搭載到PTD上并不能成功地將siRNAs導(dǎo)入細胞內(nèi)。將PTD與雙螺旋RNA附著域(double stranded RNA-binding domain,DRBD)結(jié)合,形成融合蛋白,將其命名為 PTD-DRBD。該融合蛋白掩蓋了 siRNAs的負電性,能夠高效、無毒的將siRNAs運送到許多種類的細胞中。這一發(fā)現(xiàn)被認為是siRNAs藥物給藥途徑的一項重大突破,但該技術(shù)在實際治療中的效果還需進一步研究來證實。

1.3 選擇性全身投遞siRNAs 以RNAi為基礎(chǔ)的治療必須在體內(nèi)投遞有效劑量的siRNAs,然而,非選擇性全身投遞的一個缺點是需要大量的siRNAs。針對特定細胞表面受體有選擇性地全身投遞siRNAs,可以降低給藥劑量[26]。有研究將應(yīng)用于治療的siRNAs包裝到耦聯(lián)了抗體片段或帶受體靶向配體的納米顆粒中,這些細胞特異性投遞策略有利于siRNAs通過細胞內(nèi)吞發(fā)揮作用[27]。

適體(aptamers)是 RNA或DNA結(jié)構(gòu)的配體,可以被設(shè)計與特定細胞表面受體結(jié)合,在體內(nèi)實驗中它能以共價鍵的形式與細胞特異的siRNAs連接。通過內(nèi)吞作用進入細胞后,siRNAs分子從適體釋放,通過RNAi途徑沉默靶向基因的表達。有研究顯示,將結(jié)合到前列腺特異性膜抗原(PSMA)的適體偶聯(lián)到特異靶向PSMA mRNA的siRNAs上,該抗原在前列腺癌細胞表面特異表達。將適體-siRNAs嵌合復(fù)合體注射入腫瘤內(nèi),2次/天,共注射20 d,能有效抑制小鼠模型中腫瘤的生長[28]。

納米顆粒提供了另一種選擇性全身投遞RNAi的重要途徑。這些運載工具裝載量大,能有效保護siRNAs,并能以高特異性的方式靶向細胞。另外靶向性還可以通過在納米顆粒表面附加細胞特異性配基來實現(xiàn)。有研究通過納米顆粒包裹siRNAs,在表面攜帶轉(zhuǎn)鐵蛋白配基,可以靶向Ewing肉瘤[29]。這些納米顆粒由環(huán)糊精和聚陽離子組成,包裹帶負電荷的siRNAs。

2 病毒 RNAi投遞系統(tǒng)

很多科學(xué)家認為運用病毒載體投遞RNAi藥物,是最有潛力的一種方法。因為這種手段一方面解決了非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率不高的問題,同時可以使藥物持續(xù)的在體內(nèi)進行表達,達到長期沉默目的基因、減少給藥的劑量與頻率的目的。腺病毒或腺相關(guān)病毒(AAV)的載體可以瞬時表達shRNAs,可用于治療癌癥和其他一些慢性疾病。這些非整合型載體在細胞內(nèi)大多處于游離狀態(tài),整合頻率較低,并且可以有效感染處于分裂和非分裂期的細胞,對其進行轉(zhuǎn)基因治療[25]。腺病毒和AAV載體的缺點是重復(fù)投遞可能觸發(fā)強烈的免疫反應(yīng),從而限制其在某些疾病治療中的應(yīng)用,但可以通過對其外殼進行修改來降低這種免疫反應(yīng)。

基因治療用載體已發(fā)展了近 20年,但將其應(yīng)用到基于RNAi治療中,仍然存在安全方面的問題。運用病毒載體進行基因治療最重要的問題是能否將藥物靶向作用于特定的細胞類型,并且盡量減少其不良反應(yīng)。最近的研究表明應(yīng)用病毒載體投遞RNAi取得了較好的療效[30]。

慢病毒載體能轉(zhuǎn)染分裂和非分裂細胞,將外源基因整合到宿主細胞基因組內(nèi),穩(wěn)定表達shRNAs、持續(xù)沉默目的基因。慢病毒載體常來自于人類免疫缺陷病毒(HIV)或貓免疫缺陷病毒,常常通過假型水皰性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)來擴大細胞轉(zhuǎn)染類型的范圍。有研究表明,用慢病毒載體攜帶shRNAs表達系統(tǒng)來包裝病毒,投遞到患者體內(nèi),可以達到較好的治療效果[31]。

3 結(jié)論與展望

RNAi不僅對基因調(diào)控的研究產(chǎn)生深遠的影響,也導(dǎo)致了以dsRNAs為基礎(chǔ)的一類新的治療藥物的發(fā)展。以RNAi為基礎(chǔ)的AMD和RSV治療已經(jīng)進入Ⅲ期臨床試驗,并有望在未來1～2年內(nèi)上市,同時還有針對癌癥、HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和亨廷頓病等的臨床試驗將陸續(xù)開展。從RNAi技術(shù)的最初發(fā)現(xiàn)到其在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用,這樣的發(fā)展速度是前所未有的,同時顯示出了RNAi治療的巨大潛力。

如同所有高速發(fā)展的新技術(shù)一樣,在應(yīng)用到治療過程中都可能遇到障礙。RNAi治療早期遇到的一些問題包括:誘發(fā)干擾素現(xiàn)象、脫靶現(xiàn)象和細胞毒性[26]。最近的研究結(jié)果表明,細胞內(nèi)高水平的表達shRNAs,可能產(chǎn)生對小鼠致命的毒性。不過可以通過更加合理的設(shè)計干擾片段、簡化siRNAs骨架的修飾和為shRNAs表達選擇適當?shù)膯幼?來減少上述現(xiàn)象的出現(xiàn)。最近,投遞技術(shù)的發(fā)展也促進靶向特異細胞RNAi技術(shù)的進步,通過使用諸如靶向受體的配體,連接到納米顆粒包裹的配體或單克隆抗體的可變區(qū)等,極大地提高了細胞特異的靶向性。但是,在人類疾病治療中廣泛的應(yīng)用RNAi仍存在較多的問題,例如丙型肝炎病毒或 HIV感染等疾病需要終身的RNAi治療。目前,沒有足夠多的證據(jù)來證實長期或重復(fù)使用RNAi藥物是否會觸發(fā)正常細胞新陳代謝紊亂。因為長期應(yīng)用siRNAs治療,其細胞毒性完全可能幾個月、甚至是幾年都處于潛伏狀態(tài)。

腫瘤治療的主要問題是如何針對擴散和轉(zhuǎn)移進行治療。用化療等其他形式的手段,常常使這些細胞產(chǎn)生耐藥性,導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。如何有效地將siRNAs投遞到這些細胞內(nèi)從而來摧毀癌細胞變得非常重要[31]。此外,神經(jīng)退行性疾病如亨廷頓病,也可以應(yīng)用RNAi進行治療。RNAi是一個非常有潛力的治療手段,通過全世界RNAi領(lǐng)域科學(xué)家的共同努力,在未來幾年必定會將其中存在的問題逐漸的解決,使以RNAi為基礎(chǔ)的治療得到日益廣泛的應(yīng)用[32]。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2011.05.038

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