張 寬,陳光達(dá),許信剛,童德文

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌712100)

細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)細(xì)胞在特定的內(nèi)源和外源信號(hào)誘導(dǎo)下,其死亡途徑被激活,并在有關(guān)基因的調(diào)控下發(fā)生的程序性死亡過(guò)程。動(dòng)物機(jī)體通過(guò)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制來(lái)清除體內(nèi)受損、衰老、突變和感染病原體的非正常細(xì)胞來(lái)維持機(jī)體動(dòng)態(tài)平衡。這一過(guò)程涉及一系列復(fù)雜的蛋白激酶激活的級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終將凋亡信號(hào)傳入細(xì)胞核,調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染動(dòng)物,會(huì)引起嚴(yán)重的腦炎癥狀,其發(fā)病機(jī)理可能與該病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。JEV感染易感細(xì)胞后,引起細(xì)胞生長(zhǎng)特性和形態(tài)學(xué)改變,最終死亡。已證明JEV感染細(xì)胞,通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)凋亡機(jī)制致死細(xì)胞,被感染細(xì)胞發(fā)生染色質(zhì)濃縮、DNA片段化,最終形成凋亡小體[1-2]。被感染的細(xì)胞發(fā)生典型的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及NF-kappaB等因子的激活反應(yīng),同時(shí)一些凋亡調(diào)節(jié)蛋白在該過(guò)程中發(fā)揮著不同程度的調(diào)節(jié)作用。探明JEV與易感細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是研究JEV致病機(jī)制的基礎(chǔ),并且有助于日本腦炎防治藥物的開(kāi)發(fā)。

1 JEV結(jié)構(gòu)特征

JEV屬于黃病毒科黃病毒屬,通過(guò)蚊蟲(chóng)叮咬傳播,主要侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng),臨床上表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、嘔吐、腦膜炎癥狀,病死率極高,即使耐過(guò)也會(huì)留下嚴(yán)重的神經(jīng)性后遺癥,可以引起人嚴(yán)重腦炎[3]。與其他的蟲(chóng)媒傳播的病毒一樣,JEV傳播受到昆蟲(chóng)媒介、脊椎動(dòng)物宿主、被感染的人群以及周圍環(huán)境等多種因素影響。在JEV的生活史中,人類是終末宿主,其他的脊椎動(dòng)物(如豬等)是貯藏宿主。JEV是正單鏈RNA病毒,其RNA長(zhǎng)度約為11 kb,包含一個(gè)開(kāi)放閱讀框,可編碼一個(gè)多肽鏈。這個(gè)多肽鏈被加工成為3種結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM、E)和七種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1-7)[4]。其中NS3蛋白是一個(gè)較大的多功能蛋白,包括蛋白酶活性、解旋酶活性以及5′三磷酸水解酶活性,基于這些功能,它在病毒的復(fù)制以及蛋白合成過(guò)程起重要作用[5]。JEV感染人后,主要在髓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞上增殖。沒(méi)有觀察人感染JEV有病毒血癥階段,可能是因?yàn)樵撾A段非常短暫或者根本不存在。還沒(méi)有證明JEV是否可以通過(guò)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致病毒從外周神經(jīng)向中樞神經(jīng)擴(kuò)散。

2 JEV感染細(xì)胞并改變細(xì)胞生長(zhǎng)特性

JEV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要由病毒粒子在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制引起。而JEV的非結(jié)構(gòu)蛋白可以改變宿主細(xì)胞細(xì)胞膜的通透性,從而有助于JEV進(jìn)入宿主細(xì)胞[6]。因?yàn)橛肬V處理JEV(UV-JEV),使其失去在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制能力同時(shí)保留與細(xì)胞上受體結(jié)合能力,不能再誘導(dǎo)BHK-21細(xì)胞系凋亡。然而,UV-JEV可以導(dǎo)致N18細(xì)胞系死亡。說(shuō)明JEV可能是通過(guò)受體結(jié)合激活、或者是在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、或者兩種方式并存的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[7]。

JEV在細(xì)胞內(nèi)增值會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生一系列異常變化,其中之一是該病毒在細(xì)胞內(nèi)增值可以將細(xì)胞周期抑制在G0/G1期。與其同科的登革病毒感染BHK-21和N18細(xì)胞后,明顯將細(xì)胞周期抑制在G0/G1期。激活或者抑制細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)周期的有關(guān)蛋白會(huì)打破細(xì)胞正常周期調(diào)控平衡,往往造成細(xì)胞死亡。細(xì)胞內(nèi)的周期蛋白Cyclin A是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期重要蛋白之一,它的表達(dá)量變化和重新分布部分參與細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期[8]。一些生長(zhǎng)周期被抑制在G1期的細(xì)胞不再表達(dá)Cyclin A[9]。登革病毒感染BHK-21細(xì)胞系12h后即出現(xiàn)細(xì)胞周期被抑制在G1期,18 h后G1期細(xì)胞總量可達(dá)總細(xì)胞量的71.47%,而同時(shí)間段的對(duì)照組細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生明顯的周期抑制,在感染18 h時(shí),BHK-21細(xì)胞DNA出現(xiàn)異二倍體,說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞發(fā)生凋亡。以上現(xiàn)象說(shuō)明,該病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)周期蛋白的表達(dá)和分布從而將細(xì)胞生長(zhǎng)周期抑制在G1期,繼而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[1]。

以前還沒(méi)有證明細(xì)胞周期抑制到底是病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖所必須的條件,還是病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖對(duì)細(xì)胞造成的單方面損害。實(shí)驗(yàn)證明,JEV病毒可以在表達(dá)Bcl-2的BHK-21細(xì)胞系上正常增殖,病毒滴度不會(huì)受到影響的同時(shí)細(xì)胞正常分裂,并不產(chǎn)生病變[10]?？梢哉f(shuō)明,在該細(xì)胞系上周期抑制并不是病毒復(fù)制所必須的條件。仍然存在的問(wèn)題是,病毒復(fù)制會(huì)造成細(xì)胞損傷,是抗凋亡蛋白阻止了病毒對(duì)細(xì)胞的損傷還是該蛋白賦予了細(xì)胞抗損傷的能力?

3 JEV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

3.1 線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

JEV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑之一是線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。JEV感染BHK-21和N18可以引起N18細(xì)胞色素C從線粒體釋放,接著細(xì)胞色素C激活Caspase 9、Caspase 3。用環(huán)孢菌素和釕紅可以減弱線粒體的破壞,用它們處理JEV感染的N18后,Caspase9、Caspase3激活受抑制[11]。值得一提的是,Caspase3并非JEV誘導(dǎo)凋亡所必需,JEV可以誘導(dǎo)不表達(dá)Caspase3的MCF-7凋亡,表現(xiàn)典型的凋亡特征,包括細(xì)胞色素C的釋放、Caspase9、Caspase6、Caspase8的激活[12]。

JEV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制可能不通過(guò)死亡受體途徑,或者該途徑與其他途徑并存發(fā)揮作用。細(xì)胞膜上有兩類受體與細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)到有關(guān),分別是死亡受體(Fas)和腫瘤壞死因子受體一型(TNFR-1),分別通過(guò)胞漿結(jié)構(gòu)域FADD和T RADD向細(xì)胞內(nèi)部傳導(dǎo)信號(hào)。死亡配體與死亡受體結(jié)合后可以激活死亡受體,從而胞漿面的FADD募集procaspase 8,形成死亡復(fù)合體,并激活Caspase8。FADD在死亡受體通路中起到非常重要的作用。如果將FADD突變,阻止死亡受體通路上的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),不可以阻止JEV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,也不能抑制Caspase 8的激活過(guò)程[11]。但是T RADD基因沉默后的細(xì)胞不能被JEV誘導(dǎo)凋亡,相應(yīng)的caspase3也不能被激活,說(shuō)明TRADD參與JEV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。病毒感染細(xì)胞后,在細(xì)胞中大量復(fù)制,使細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS、線粒體內(nèi)Ca2+濃度異常升高,繼而導(dǎo)致線粒體膜電位降低、外膜通透性改變、PT孔開(kāi)放,釋放細(xì)胞色素C等激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),效應(yīng)酶進(jìn)入細(xì)胞核特異性作用于細(xì)胞DNA,將DNA切為200 bp左右的片段,最終細(xì)胞凋亡。

ROS在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中占有重要地位,從凋亡細(xì)胞中分離出來(lái)的線粒體可以產(chǎn)生過(guò)氧化物。作為凋亡抑制蛋白的Bcl-2在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)時(shí)候可以抑制細(xì)胞色素C的釋放和ROS的產(chǎn)生。UV-JEV感染細(xì)胞使細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量ROS,導(dǎo)致細(xì)胞死亡,這種死亡機(jī)制與Caspase和細(xì)胞色素C沒(méi)有明顯聯(lián)系[14]。一些抗氧化劑如硫氧還蛋白、NAC、MnSOD,可以延緩細(xì)胞凋亡。硫氧還蛋白可以抑制ASK1的激活過(guò)程,而ASK1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過(guò)程中ROS介導(dǎo)的P38MAPK信號(hào)通路,故硫氧還蛋白間接抑制JEV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。

3.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

JEV在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖過(guò)程主要在胞漿,然后在細(xì)胞內(nèi)部的膜結(jié)構(gòu)上成熟,包括粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體?？捎^察到在被JEV感染的細(xì)胞內(nèi)部膜結(jié)構(gòu)有上大量的病毒粒子堆積[16]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不但是細(xì)胞蛋白質(zhì)成熟加工的場(chǎng)所,它還是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳輸中轉(zhuǎn)站。其發(fā)揮功能的機(jī)制之一就是通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子的釋放而傳輸細(xì)胞受到的刺激信號(hào)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)部的動(dòng)態(tài)平衡被打破時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非常敏感,立即傳輸信號(hào)到胞漿和核,決定細(xì)胞是適應(yīng)生存還是走向凋亡,這就是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。電鏡觀察JEV感染的細(xì)胞有明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生肥大,發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[16]。

細(xì)胞受到不良刺激時(shí),包括病毒感染,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生的主要反應(yīng)之一就是非蛋白折疊反應(yīng)(UPR)激活一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核[17]。UPR以一些分子伴侶的表達(dá)提高為特征,包括葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GPRs)、Bip/GRP78、GRP94等。此外,發(fā)生UPR后時(shí),細(xì)胞內(nèi)部蛋白翻譯被全面抑制在起始階段,從而降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面非折疊蛋白的堆積,緩解和修復(fù)細(xì)胞損傷。當(dāng)細(xì)胞損傷過(guò)于嚴(yán)重或者急促,UPR不足以或者來(lái)不及修損傷,細(xì)胞就會(huì)激活凋亡機(jī)制[18]。發(fā)生ERs會(huì)引起與死亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子CHOP強(qiáng)表達(dá),CHOP的過(guò)量表達(dá)可以使細(xì)胞周期停滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。過(guò)量表達(dá)并激活CHOP還會(huì)同時(shí)下調(diào)Bcl-2的表達(dá)和ROS的產(chǎn)生。ERs產(chǎn)生的凋亡信號(hào)會(huì)下傳到細(xì)胞核,CHOP可能是UPR介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路中下游成員。JEV還可能通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑,在P38MAPK的參與下激活CHOP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,因?yàn)閜38MAPK可以增強(qiáng)CHOP的表達(dá)和激活。CHOP可能是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游成員。因?yàn)镴EV感染細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生明顯UPR并有CHOP和P38MAPK的激活[16,19]。P38MAPK在JEV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中除了參與調(diào)節(jié)CHOP的表達(dá)激活外,起到關(guān)鍵性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,被感染的細(xì)胞中磷酸化P38MAPK的量高于正常細(xì)胞[20],加入P38MAPK抑制劑后,JEV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率減少了33%[21]。

3.3 NF-κ B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

NF-κ B是一種能與免疫球蛋白kappa鏈基因增強(qiáng)子κ B序列特異結(jié)合,并能促進(jìn)kappa鏈基因表達(dá)的核蛋白因子。它廣泛存在于真核細(xì)胞中,調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞復(fù)制和存亡。NF-κ B活化過(guò)程未受到刺激時(shí),在細(xì)胞中處于未活化狀態(tài),不具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的能力。當(dāng)抑制NF-κ B磷酸化的蛋白Iκ B-α降解后,NF-κ B就可以被磷酸化激活,從胞漿復(fù)合物上解離進(jìn)入細(xì)胞核,與細(xì)胞核內(nèi)目的基因上的κ B元件結(jié)合,調(diào)節(jié)基因表達(dá),調(diào)控細(xì)胞的調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)、復(fù)制、凋亡、免疫和胚胎發(fā)育。當(dāng)病毒的衣殼蛋白與細(xì)胞的受體結(jié)合后,NF-κ B被激活,它對(duì)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有雙重作用,這與病毒種類有關(guān)。對(duì)于有些病毒,如sindbis病毒和JEV,NF-κ B激活對(duì)病毒誘導(dǎo)凋亡有促進(jìn)作用。病毒基因組啟動(dòng)子中有一個(gè)NF-κ B結(jié)合位點(diǎn),當(dāng)結(jié)合了NF-κ B后,病毒的致病性增強(qiáng)。試驗(yàn)證明,JEV感染細(xì)胞后,檢測(cè)到激活的NF-κ B,當(dāng)人為阻斷NF-κ B的激活過(guò)程,JEV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在一定程度上受到抑制。說(shuō)明NF-κ B在JEV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[22]。

NF-κ B可能與細(xì)胞的抗病毒作用有關(guān)。在研究不同抗病毒藥物作用機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn),不同藥物的抗病毒機(jī)理不同。阿司匹林可以抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,在藥物作用下,細(xì)胞內(nèi)NF-κ B激活過(guò)程同時(shí)受到抑制,說(shuō)明該藥物的抗病毒機(jī)制部分作用于細(xì)胞,并且調(diào)節(jié)NF-κ B的活性。而另一類藥物水楊酸,可以抑制JEV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,經(jīng)檢測(cè),藥物作用下細(xì)胞中的NF-κ B激活過(guò)程未受影響,同時(shí)JEV的毒力沒(méi)有明顯變化,說(shuō)明水楊酸的抗病毒作用是通過(guò)與NF-κ B無(wú)關(guān)的一種單方面作用于細(xì)胞的機(jī)制發(fā)揮的[23]。

3.4 Bcl-2家族

Bcl-2家族在脊椎動(dòng)物細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中其重要的調(diào)節(jié)作用,目前還不斷有新的該家族的成員被發(fā)現(xiàn)。Bcl-2家族蛋白結(jié)構(gòu)中有四個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,稱為Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域,分別是BH1、BH2、BH3、BH4在人類所知的所有的Bcl-2家族成員的蛋白結(jié)構(gòu)中,都至少包含有一個(gè)Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域。Bcl-2家族既有抗凋亡成員也有促凋亡成員。在細(xì)胞凋亡、腫瘤生長(zhǎng)、胚胎發(fā)育過(guò)程中起到調(diào)節(jié)作用。多數(shù)的抗凋亡成員都含有BH1和BH2,比較典型的代表是Bcl-XL,它同時(shí)包含有以上四個(gè)同源結(jié)構(gòu)域,與Bcl-2非常相似。然而幾乎所有的Bcl-2家族的成員都含有BH3,包括Bax、Bik和Bcl-Xs,其中Bcl-XL和Bcl-Xs由同一開(kāi)放閱讀框翻譯的蛋白切割而成。

Bcl-2和Bcl-XL對(duì)于JEV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)作用研究相對(duì)較多,Bcl-2在線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中作用于線粒體外膜,抑制細(xì)胞凋亡。但是不參與死亡受體通路的調(diào)節(jié)。JEV感染不同細(xì)胞系,Bcl-2和Bcl-XL的作用不盡相同,提示JEV誘導(dǎo)不同細(xì)胞的凋亡途徑略有差異。JEV誘導(dǎo)不同細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)上相似,生化通路上有所區(qū)別。電鏡觀察感染JEV的細(xì)胞核發(fā)生異常變化,染色質(zhì)濃縮邊緣化和DNA片段化[24],而過(guò)表達(dá)Bcl-2的BHK-21細(xì)胞系感染JEV無(wú)此變化。這一現(xiàn)象表明,Bcl-2在BHK-21上表達(dá)可以抑制JEV誘導(dǎo)的凋亡。然而在N18細(xì)胞系上Bcl-2不表現(xiàn)此功能,它不能阻止或延緩JEV誘導(dǎo)N18凋亡[1]?？梢?jiàn),不同細(xì)胞中,Bcl-2發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)功能,也就是說(shuō),它調(diào)節(jié)凋亡具有細(xì)胞特異性。即使是在同一細(xì)胞系,在不同刺激物作用下,Bcl-2的調(diào)節(jié)功能也不盡相同,辛德畢斯病毒感染或無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)N18,Bcl-2表現(xiàn)有抗凋亡功能。另外,以上事實(shí)提示,Bcl-XL和Bcl-2可能分別在神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織細(xì)胞中發(fā)揮作用。JEV感染細(xì)胞后,不但會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路,還會(huì)激活保護(hù)細(xì)胞不致死亡的PI3K/Akt信號(hào)通路。在凋亡早期,該信號(hào)通路有一定抑制凋亡作用,Bcl-2在該信號(hào)通路上游擔(dān)任重要角色[25]。

4 結(jié)語(yǔ)

JEV感染細(xì)胞,既可以引起細(xì)胞凋亡,也可以導(dǎo)致細(xì)胞壞死[11]。但是,JEV感染細(xì)胞,在什么水平上可以誘導(dǎo)凋亡,在什么水平上可以導(dǎo)致壞死,二者是否與JEV感染的方式或者毒力有關(guān),還有待于研究。JEV感染細(xì)胞產(chǎn)生CPE、誘導(dǎo)凋亡和壞死的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還不明晰,仍存在一系列待解答的問(wèn)題。JEV誘導(dǎo)凋亡的線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路之間如何聯(lián)系,在沒(méi)有FADD參與下JEV仍然可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),凋亡通路是僅由線粒體途徑承擔(dān)還是與死亡受體途徑共同承擔(dān)?JEV誘導(dǎo)凋亡檢測(cè)到Caspase8激活,那么此處的Caspase8上游成員是誰(shuí),與ERs有怎樣的聯(lián)系?細(xì)胞內(nèi)Caspase12的激活是JEV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的上游因素還是僅僅是JEV引起ERs的一個(gè)與凋亡無(wú)關(guān)結(jié)果?JEV刺激激活的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與JEV引起細(xì)胞CPE以及凋亡有怎樣的聯(lián)系?這些問(wèn)題仍有待于深入研究探討。

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