孫 巖,王 路,溫俊歌,薄聯(lián)鋒,徐志坤,張德禮*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院,陜西楊陵712100;2.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,河北保定071000)

防御素(defensins)廣泛存在于生物界,具有廣譜抗微生物活性,屬于生物體天然免疫系統(tǒng),是古老防御機制的一部分。β-防御素是Diamond等1991首先在牛的氣管黏膜上皮細胞中發(fā)現(xiàn)的,后又在牛粒性白細胞中發(fā)現(xiàn)了13種與其高度相似的序列,但共有序列與α-防御素不同,故被命名為β-防御素,主要分布于牛的骨髓以及人和多種動物(牛、羊、豬、駱駝、馴鹿、小鼠、大鼠)的胃腸道、呼吸道、舌、牙齦、腎、皮膚的上皮中。

1 防御素的種類與β-防御素的結(jié)構(gòu)

防御素是一類富含半胱氨酸和精氨酸的內(nèi)源性陽離子低分子抗微生物短肽。根據(jù)防御素分子內(nèi)半胱氨酸和精氨酸的位置、連接方式、前體性質(zhì)及表達位置的差異可分為5種類型,即α-防御素,β-防御素,θ-防御素,昆蟲防御素,植物防御素。

成熟的β-防御素由38～42個氨基酸殘基組成,它的分子結(jié)構(gòu)中含有6個保守的半胱氨酸殘基,分子中二硫鍵連接方式為Cys1-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6。β-防御素由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成,外顯子1編碼防御素前體分子的信號肽序列和部分前片段序列,外顯子2編碼部分前片段序列和成熟肽序列。

2 天然免疫系統(tǒng)

天然免疫系統(tǒng)是宿主抵抗多種病原微生物的第一道防線,在感染后迅速被激活,抑制病原的復制。天然免疫機制包括物理防線、體液免疫和細胞免疫等方面。物理防線是最外層的屏障,包括皮膚、內(nèi)皮層以及他們分泌的因子。一旦病原突破第一道防線,天然免疫細胞就會被激活繼而分泌細胞因子和趨化因子來抑制病原體的復制。先天免疫細胞激活的基礎(chǔ)即模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)在很多免疫細胞中表達,如巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞。由于這些受體的存在,天然免疫細胞可以識別許多微生物共有的保守結(jié)構(gòu)。目前研究最多的模式識別受體是Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)。

3 β-防御素的抗病原體活性

作為天然免疫的一部分,β-防御素可以保護宿主免受多種病原體的入侵,如細菌、真菌、病毒、寄生蟲等。

在抗菌方面,β-防御素有廣譜、高效的抗菌活性。一方面β-防御素能穿透菌體細胞壁和細胞膜,殺死一些耐抗生素的細菌[1],另一方面即使是合成的類似人β-防御素(humen beta defensin,hBD1-3)碳末端結(jié)構(gòu)域的多肽同樣具有抗菌活性[2],經(jīng)其處理過的大腸埃希菌有明顯的形態(tài)學變化。然而β-防御素也有偏好性,如hBD2優(yōu)先殺死革蘭陰性菌綠膿桿菌,而非革蘭陽性菌葡萄球菌。同時不同種類的β-防御素抑菌機制也不同,hBDs可以黏附于結(jié)核分支桿菌的細胞膜,而hBD3還可以抑制葡萄球菌細胞壁的生成[3]。此外Scudiero O等[4]通過比較7種人工合成的hBD類似物確定了β-防御素發(fā)揮抗菌活性的核心結(jié)構(gòu)域,如hBD1、hBD3的核心結(jié)構(gòu)域分別位于肽鏈中部和羧基端。

在抗真菌方面,研究表明防御素尤其是β-防御素在體外可以殺死或抑制真菌的繁殖,如hBD1[5]可以抑制多種念珠菌如白念珠菌、克柔假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌,而hBD2和hBD3雖有類似的抑制真菌的效果,但對光滑假絲酵母菌不起作用。此外,防御素還可以阻止光滑假絲酵母黏附到上皮細胞從而抑制其感染。

在抗病毒方面,β-防御素可以抑制多種被膜病毒的感染。hBD2、hBD3抑制人類免疫缺陷病毒(HIV-1)的復制;在傳染性軟疣病毒感染患處,hBD3的表達量大幅上升[6];豬源β-防御素(porcine beta defensin,pBD3)能顯著抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染猴腎細胞Marc-145[7];hBD2在抗呼吸道合胞病毒(RSV)中發(fā)揮重要作用,主要機制為RSV激活NF-κ B信號通路,介導產(chǎn)生促炎癥細胞因子-腫瘤壞死因子(TNF),從而調(diào)節(jié)hBD2的表達[8]。試驗表明體外重組鼠β-防御素(murine beta defensin,mBD)可以阻止流感病毒入侵,從而抵抗病毒感染[9]。

在抗寄生蟲方面,hBD1和hBD2可以在腸道內(nèi)有效抑制多種隱孢子蟲孢子發(fā)芽,從而抑制體內(nèi)隱孢子蟲孢子的感染。

β-防御素的抗菌活性依賴于離子種類和濃度,如Vylkova S等[10]發(fā)現(xiàn)hBD2殺死白念珠菌依賴于鹽離子濃度。β-防御素對鹽離子敏感的程度不同,在hBD1-4中hBD3是最不敏感的。

4 β-防御素與炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)可以使組織消除有害刺激,啟動組織愈合。但是不恰當?shù)难装Y反應(yīng)會導致組織損壞甚至疾病,所以當機體不再需要炎癥反應(yīng)時應(yīng)當立即終止。就這一點而言,β-防御素在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。終止的機制首先是β-防御素刺激產(chǎn)生內(nèi)源分子如抗炎癥細胞因子、脂質(zhì)介質(zhì)、糖皮質(zhì)激素,其次是誘導免疫細胞凋亡。

β-防御素可以誘導產(chǎn)生炎癥因子和趨化因子。研究表明hBD2-4能夠刺激角質(zhì)細胞釋放細胞因子和趨化因子如IL-6、IL-10、IFN-γ誘導蛋白(IFN-γinducible protein,IP-10)、單核細胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein,MCP-1)等來激活T細胞表達和細胞因子分泌[11]。

還有研究表明hBDs能夠調(diào)節(jié)炎癥因子,對外周血中性粒細胞(peripheral blood neutrphils,PMN)的凋亡產(chǎn)生影響,Nagaoka I等[12]證明hBDs能夠抑制PMN的凋亡,延長細胞周期從而防御病原菌入侵,其主要機制為hBDs尤其是hBD3可以激活人趨化因子受體(chemokine(C-C motif)receptor 6,CCR6),從而下調(diào)促凋亡蛋白truncated Bid的表達,上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達,同時抑制線粒體膜半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)的活性。另外,hBD2可以促進臍靜脈內(nèi)皮細胞管道形成,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)時的血管生成。

5 β-防御素與趨化作用

β-防御素除了具有直接的抗病原微生物活性以外,還可以在天然免疫中發(fā)揮趨化作用。不同的防御素在特定濃度時可以選擇性趨化天然免疫系統(tǒng)中的白細胞,通過吞噬方式來抵御和消滅入侵的病原微生物,hBD1趨化單核細胞,hBD2趨化肥大細胞,hBD3-4趨化巨噬細胞[13]。另外hBD2功能[14]類似于血管內(nèi)皮生長因子,達到一定劑量后,促進傷口愈合以及內(nèi)皮毛細血管的形成。

此外,防御素可以趨化非成熟的樹突狀細胞(immature dendritic cells,iDCs),在感染部位獲取和遞呈病原微生物抗原,啟動特異性免疫應(yīng)答。其中,β-防御素趨化作用是最強的,試驗證明,hBD2、hBD3以及mBDs可以和CCR2相互作用介導趨化作用,Rohrl J等[15]體外試驗表明,mBD4和hBD2對表達CCR6的小鼠細胞均有趨化作用。還有試驗表明mBD2即使在LPS結(jié)合蛋白不存在的情況下,也可以通過上調(diào)共刺激分子CD40、CD80、CD86、MHCII、CCR7,直接作用于iDCs促進DC的成熟[16],mBD2介導的成熟DCs可以促進Th1的極化以及促炎癥細胞因子的產(chǎn)生。

二硫鍵連鍵模式對β-防御素的趨化功能有重要意義[17]。真核表達hBD3活性研究表明,當所有半胱氨酸殘基被替代以后,二硫鍵消失,hBD3趨化活性喪失。防御素的趨化作用具體機制尚不明確,目前主要有三種假設(shè):替換配體模型、膜破裂模型、反式激活模型[18]。

6 β-防御素與Toll樣受體

大量證據(jù)表明,防御素和T LRs有密切的聯(lián)系,尤其是β-防御素和細胞外T LRs[19]。例如鼠的β-防御素2(murine beta defensin 2,mBD2)通過T LR4激活NF-κ B信號通路[20]。在轉(zhuǎn)染TLR4和鼠髓樣分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2,MD2)的人胚胎腎細胞(human embryonic kidney,HEK)293中,mBD2可以激活NF-κ B,而不轉(zhuǎn)染的NF-κ B則不能被激活。具體機制為mBD2是T LR4的內(nèi)源性配體,可以介導樹突狀細胞(DC)的成熟。而人工合成的hBD3既可以激活DC又可以殺死DC。還有報道顯示hBD3通過MyD88/IRAK/NF-κ B信號通路與T LR1和TLR2相互作用,激活專職抗原遞呈細胞[21]。由此可見,β-防御素通過與受體相互作用,能夠很好調(diào)節(jié)抗原遞呈細胞的功能狀態(tài),從而發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。

另外,活化的T LRs可以促進β-防御素產(chǎn)生并調(diào)節(jié)其活性。人膽管上皮的T LR2和TLR4的激活,不同程度的促進hBDs的產(chǎn)生,從而提高宿主抗隱孢子蟲感染的能力。角膜上皮細胞經(jīng)綠膿桿菌感染后,用低劑量鞭毛蛋白(T LR5激動劑)處理,結(jié)果不僅使hBD2的mRNA的表達量增加,TNF-α和IL-8分泌也增多[22]。同時Sumikawa Y等[23]通過鼠試驗表明,脂多肽可以通過T LR2/MyD88依賴的信號通路,刺激角質(zhì)形成細胞中mBD3的表達,提高TNF-α和IL-1α的分泌。

7 結(jié)語

細菌對抗生素的耐藥性是當今臨床醫(yī)學中的全球性難題,開發(fā)新的抗感染藥物勢在必行。而β-防御素具有高效、廣譜的抗菌作用,且不會產(chǎn)生耐藥性和毒副作用,有很大的藥用價值,同時對免疫細胞有趨化功能,參與免疫調(diào)節(jié),可以作為佐劑調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)。雖然目前對于防御素的應(yīng)用還有許多問題亟待解決,但是隨著科技的不斷進步,β-防御素的研究將不斷深入,有助于闡明某些疾病的發(fā)病機制,并為開發(fā)新型抗菌藥物提供理想的分子骨架和模板,給治療一些頑固的感染性疾病帶來新的希望。

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