陶金程,漢麗梅,劉 佳,于天明

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué),遼寧沈陽(yáng)110866)

腫瘤是機(jī)體在各種致癌因素作用下,局部組織的某一個(gè)細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控,導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的新生物,腫瘤的發(fā)生是多階段、多步驟的復(fù)雜過程。近年來,人們注意到幾乎所有的癌基因、抑癌基因都直接或間接地參與了細(xì)胞周期的調(diào)控,有的其本身就是細(xì)胞周期調(diào)控的主要成分,它們的異常表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控,p27蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的CDKI家族成員之一,是一類重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白,目前已成為腫瘤研究的一個(gè)熱點(diǎn)。端粒酶是一種核糖蛋白酶,具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性,能以端粒酶RNA(hTR)為模板,向染色體末端添加T2AG3序列,端粒酶對(duì)腫瘤細(xì)胞獲得無限增殖特性進(jìn)而成為永生化細(xì)胞起了重要作用。文章針對(duì)p27,p27與腫瘤、端粒酶的關(guān)系進(jìn)行了綜述。

1 p27 Kip1概述

1.1 p27 Kip1基因

Polyak K等在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming grow th factor-β,TGF-β)和經(jīng)細(xì)胞接觸處理的生長(zhǎng)抑制細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種相對(duì)分子質(zhì)量為27 000的熱穩(wěn)定蛋白。這種物質(zhì)在體外與細(xì)胞周期蛋白ECDK2和細(xì)胞周期蛋白D-CDK4緊密結(jié)合,并以一種化學(xué)劑量的關(guān)系抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinases,CDKs)的活性,因此被稱為p27 Kip1(p27或kip1)。p27基因定位于人體12號(hào)染色體的12p12.0～12p13.1交界處。含有兩個(gè)參與編碼的外顯子,能編碼一個(gè)198氨基酸的多肽。真核生物細(xì)胞周期失控是細(xì)胞增殖過度及癌變的重要原因,在細(xì)胞周期中有3個(gè)調(diào)控點(diǎn),這3個(gè)調(diào)控點(diǎn)分別是G0-G1、G1-S、G2-M,其中G1-S期和G2-M期最為重要,細(xì)胞一旦通過G1-S1期,它就進(jìn)入DNA合成期,如果DNA受到損傷且未得到正確修復(fù),細(xì)胞就不能通過G2-M期。參與細(xì)胞周期調(diào)控的主要分子有,細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、CDKs和CDK抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitors,CDKI)。其中CDKI按照結(jié)構(gòu)和功能的不同分成兩大類,一類是Ink4(inhibitor of cdk4),包括p15、p16、p18、pl9;另一類是Cip/Kip(CDK-interacting protein/kinase inhibition protein),包括p21Cip-1、p27Kip-1和p53 Kip-2。CDKI是近幾年來分離得到的一類重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白,參與細(xì)胞G1期進(jìn)入S期的負(fù)調(diào)控,可防止細(xì)胞過度增殖和惡變。p27基因?qū)儆贑DKI家族成員之一[1],通過多種方式參與細(xì)胞周期調(diào)控,最終抑制細(xì)胞的分裂和增殖,促進(jìn)細(xì)胞的分化和凋亡。

1.2 p27 Kip1蛋白

Toyoshima H等用酵母雙雜交系統(tǒng),在研究與cyclinD-CDK4相互作用的蛋白時(shí),克隆了鼠的p27cDNA,其片段長(zhǎng)茺為591 bp,蛋白由197個(gè)氨基酸組成。人的p27cDNA長(zhǎng)為594 bp,其蛋白由198個(gè)氨基酸組成。研究發(fā)現(xiàn),p27是高度保守的蛋白分子,在鼠、貂中p27蛋白的氨基酸順序非常相似,有90%的同源性。p27蛋白的有序結(jié)構(gòu)剛性卷曲、β-發(fā)夾和β-鉸鏈等疏水性殘基在形成cyclin-CDK2-p27三元復(fù)合物時(shí)的分子間接觸中起重要作用。β-鉸鏈在主鏈間形成的6個(gè)氫鍵及310-螺旋插入到CDK2的催化集團(tuán)能穩(wěn)定三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。Mont法模顯示p27蛋白β-發(fā)夾和β-鉸鏈二級(jí)機(jī)關(guān)形成的天然分子間界面是形成三元復(fù)合物快速動(dòng)力學(xué)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵[2]。Verkhivker C M等[3]曾通過改變退火溫度研究了分子間作用對(duì)p27三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的影響。p27蛋白通過化學(xué)計(jì)量方式與CDK或cyclin/CDK復(fù)合物結(jié)合,抑制cyclin/CDK復(fù)合物的活性,阻止細(xì)胞周期中G1到S期的轉(zhuǎn)換,使細(xì)胞周期停滯于G1期,抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)介導(dǎo)細(xì)胞間黏附及誘導(dǎo)凋亡[4]。p27蛋白通過N-末端與cyclin/CDK復(fù)合物結(jié)合,阻斷了cyclin/CDK復(fù)合物和ATP結(jié)合,導(dǎo)致CDK裂解,最終抑制了cyclin/CDK的活性[5]。通過轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后調(diào)節(jié)p27蛋白表達(dá)水平是調(diào)控p27抑制功能發(fā)揮的主要機(jī)制[6]。p27活性調(diào)節(jié)一個(gè)主要機(jī)制是磷酸化,其具有多個(gè)酪氨酸、絲氨酸、或蘇氨酸的磷酸化位點(diǎn)。p27對(duì)cyclin/CDK復(fù)合物活性的抑制作用比較弱,其實(shí)現(xiàn)是通過相關(guān)蛋白磷酸化[8-9]。

2 p27 Kip1與腫瘤

p27可以以多種方式參與細(xì)胞周期調(diào)控,最終抑制細(xì)胞分裂和增殖,促進(jìn)細(xì)胞分化和凋亡,因此,它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷及治療均存在密切的關(guān)系。

2.1 p27 Kip1基因在腫瘤中的研究

p27蛋白是一種非常規(guī)的抑癌因子,因?yàn)樗幕蛲蛔冊(cè)谀[瘤中非常罕見,這意味著在腫瘤的發(fā)展中蛋白質(zhì)的正常功能被破壞[10]。同時(shí)細(xì)胞周期各時(shí)相中p27mRNA水平無明顯改變,而p27蛋白的表達(dá)卻體現(xiàn)出時(shí)相特異性,其表達(dá)水平在GO期細(xì)胞中最高,S期其表達(dá)水平下降,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)DNA合成達(dá)到高峰時(shí),降至最低,提示p27蛋白表達(dá)的改變可能是翻譯或翻譯后水平的調(diào)節(jié)的結(jié)果。p27基因與腫瘤的關(guān)系則主要體現(xiàn)于p27蛋白水平而非基因水平的改變[11]。Kawamata N等運(yùn)用Southern雜交和聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)技術(shù)檢測(cè)432例多種(包括胃癌、卵巢癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等)惡性腫瘤和20株癌細(xì)胞株中的p27基因突變,僅發(fā)現(xiàn)l例第109位密碼子的多態(tài)性和l例靜止突變,其余均無基因突變、缺失和重排等異常。

2.2 p27 Kip1蛋白在腫瘤的表達(dá)及臨床意義

在細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制中,p27是最關(guān)鍵的抑制因子之一,幾乎可以抑制所有的CDK和cyclin復(fù)合物激酶活性[12],它是一個(gè)不僅能調(diào)控細(xì)胞周期還能抑制細(xì)胞分裂的重要因子[13],在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡等過程中都起著非常重要的作用。越來越多的證據(jù)表明p27蛋白可能成為多種人類腫瘤的獨(dú)立預(yù)后因子和未來腫瘤治療的新靶點(diǎn)[14]。研究表明,p27基因在靜止細(xì)胞內(nèi)含量較高,而在增殖細(xì)胞內(nèi)其含量非常低,因此認(rèn)為p27蛋白表達(dá)水平及活性改變與腫瘤的形成及預(yù)后有關(guān),p27的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)導(dǎo)致其失活及降解增加,與癌癥的發(fā)展相關(guān)[15-16]。目前研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)婦科腫瘤都存在p27蛋白表達(dá)異常,且影響某些疾病的預(yù)后[17]。吳芃等[18]研究發(fā)現(xiàn)p27蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá),腎癌組表達(dá)率明顯低于正常組(P＜0.05),且在腫瘤不同的臨床分期及病理分級(jí)間的表達(dá)有顯著差異(P＜0.05);p27mRNA的表達(dá)在正常組織和腎癌組織中無明顯差異,表明p27的表達(dá)調(diào)控可能是基于翻譯階段的蛋白降解,p27低表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤的演進(jìn)與發(fā)展。鄧榮輝等[19]用免疫組化的方法研究乳腺癌中p27表達(dá)表明,60例正常乳腺組織與乳腺癌組織中p27高表達(dá)率相比,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。乳腺癌組織中p27高表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān),與正常乳腺組織相比,p27的表達(dá)降低與乳腺癌的發(fā)生有明顯關(guān)系。魏茂富等[20]采用免疫組化方法,分別檢測(cè)20例正常大腸黏膜、22例大腸腺瘤和69例大腸癌中p27蛋白表達(dá)情況,高、中和低分化大腸腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別是100.00%、88.24%和31.91%,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明高分化腺癌與中分化腺癌相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000),而兩者與低分化腺癌相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),表明P27的表達(dá)與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān),而與臨床其他病理因素均無相關(guān)性(P＞0.05),故p27蛋白檢測(cè)可作為評(píng)價(jià)大腸癌惡性程度的重要指標(biāo)。膀胱移行細(xì)胞癌(bladder transitional cell carcinoma,BTCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,具有生長(zhǎng)緩慢、多中心性、易復(fù)發(fā)等臨床特點(diǎn),李朝爭(zhēng)等[21]證實(shí)p27在膀胱移行細(xì)胞癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于正常黏膜組織,p27在BTCC中表達(dá)水平與腫瘤病理分級(jí)、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均顯著相關(guān)。p27陽(yáng)性表達(dá)隨惡性程度增加而降低,提示p27與BTCC發(fā)生發(fā)展有關(guān),可能抑制腫瘤的惡性表型,抑制腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。還如外源性p27基因可作為目的基因用于腫瘤的基因治療,在這方面也有相關(guān)報(bào)道,如將外源性p27基因?qū)胄切文z質(zhì)瘤細(xì)胞,可使外源性p27基因在這些腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá),明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

3 p27 Kip1與端粒酶

端粒酶活性與細(xì)胞周期調(diào)控之間的關(guān)系尚不十分清楚,但有研究表明端粒酶活性與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)。通過研究證實(shí)在細(xì)胞周期的不同時(shí)期端粒酶的活性不同,阻滯于G1/S期的腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性與非同步培養(yǎng)物中活性水平相仿[16];通過S期時(shí)端粒酶活性增高,S期細(xì)胞可檢出最高水平的端粒酶活性;而在G2/M期幾乎檢測(cè)不到端粒酶活性,這些試驗(yàn)結(jié)果建立了端粒酶和細(xì)胞周期運(yùn)行間的細(xì)胞周期依賴性調(diào)節(jié)的關(guān)系。p27作為一種非特異性的多功能CDKI,通過多種方式對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行負(fù)性調(diào)控,從而使細(xì)胞停滯于G1期,抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,其主要功能是抑制G1期復(fù)合物cyclin-CDK的活性,阻止細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)化,從而抑制細(xì)胞增殖[22]。Kondo S等認(rèn)為p27蛋白的表達(dá)與端粒酶活性可能有聯(lián)系。細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑p27是細(xì)胞周期G1期限制性位點(diǎn)的調(diào)控因子[23],而端粒酶活性的表達(dá)是惡性腫瘤細(xì)胞無限增殖的分子基礎(chǔ),抑制細(xì)胞端粒酶活性,將導(dǎo)致細(xì)胞端粒變短并激活細(xì)胞衰老途徑[24]。p27蛋白作為CDK抑制劑(CKI)CIP/KIPI家族成員之一能與各種CDK復(fù)合物、周期蛋白A、E、D1、D2和D3都能相互作用,并引起細(xì)胞生長(zhǎng)停止于Gl期;而端粒酶在細(xì)胞周期G1期活性明顯升高、S期達(dá)到高峰。端粒酶與p27蛋白間確切的相互作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 展望

p27基因作為一種新的腫瘤候選抑制基因正越來越引起人們的研究興趣,但對(duì)于p27作用的機(jī)制目前還知之甚少,甚至可能還有很多功能沒有被發(fā)現(xiàn)。對(duì)p27進(jìn)行修飾后能否起到更有效的腫瘤治療效果,其對(duì)于某些腫瘤的預(yù)后和指導(dǎo)治療作用能否真正用于臨床。此外端粒酶活性與p27在細(xì)胞周期調(diào)控之間的關(guān)系,兩者在細(xì)胞衰老中到底有何作用,以及在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療方面的作用,有待進(jìn)一步研究。相信隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,這些問題都將獲得圓滿解決。

[1] Chan H L,Hui A Y,Wong M L,et al.Genotype C hepatitis B virus infection is associated with an increased risk of hepatocelhlar carcinoma[J].Gut,2004,53(10):1494-1498.

[2] Verkhivker C M.Protein conformational transitions coupled to binding in molecular recognition of unstructured proteins:hierarchy of structural loss from all-atom Monte Carlo simulations of p27Kip1 unfolding-unbinding and structural determinants of the binding mechanism[J].Biopolymers,2004,75(5):420-433.

[3] Zhang W,T ong Q,Wu Q,e t al.Upregulated p27kip1 can downregulate survivin expression and inhibit telomerase activity in gastric carcinoma cel[J].Cancer Invest,2009,27(9):898-900.

[4] Hong YB,Kang HJ,et al.Inhibition of cell proliferation by a resveratrol analog in human pancreatic and breast cancer cells[J].Exp Mol Med,2009,41:151-160.

[5] Verkhivker C M.Protein conformational transitions coupled to binding in molecular recognition of unstructured proteins:deciphering the effect of intermolecular interactions on computational structure prediction of the p27Kip1 protein bound to the cyclin A-cyclin-dependent kinase 2 complex[J].Proteins,2005,58(3):706-716.

[6] Bagui T K,Cui D,Roy S,et al.Inhibition of p27KIP1 gene transcription by mitogens[J].Cell Cycle,2009,8:115-124.

[7] Trabosh V A,Divito K A,D Aguda B,et al.Sequestration of E12/E47 and suppression of p27KIP1 play a role in Id2-induced proliferation and tumorigenesis[J].Caroinogenesis,2009,30:1252-1259.

[8] Morishita D,Katayama R,Sekimizu K,et al.Pimkinases promote cell cycle progression by phosphory lating and down-regulating p27Kip1 at the transcriptional and posttranscriptional levels[J].Cancer Res,2008,68:5076-5085.

[9] Tossidou I,Dangers M,Koch A,et al.Tyrosine phosphatase SHP-2 is a regulator of p27(KIP1)tyrosine phospho rylation[J].Cell Cycle,2008,7:3858-3868.

[10] Lee J H,Kim S S.The function of p27KIP1 during tumor development[J].Exp Mol Med,2009,41(11):765-771.

[11] Cariou S,Donovan J C,Flanagan W M,et al.Down-regulmion of p21WAFI/CIPI or p27Kip1 abrogates antiestrogen-mediated cell cycle arrest in human breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(16):9042-9046.

[12] Conradie R,Bruggeman F J,CilibertoA,et al.Restriction point control of the mammalian cell cycle via the cyclinE/Cdk2:p27 complex[J].FEBS J,2010,277(2):357-367.

[13] Vervoorts J,Lüscher B.Posttranslational regulation of the tumor suppressor p27(KIP1)[J].Cell Mol Life Sci,2008,65(20):3255-3264.

[14] Chu I M,Hengst L,Slingerland J M.The CDK inhibitor p27 in human cancer:prognostic potential and relevance to anticancer therapy[J].Nat Rev Cancer,2008,8:253-267

[15] Dan D,Hershko M D.Oncogenic properties and prognostic implications of the ubiquitin ligase Skp2 in cancer[J].Cancer,2008,112:1415-1424.

[16] Mishra A,Godavarthi S K,Jana N R.UBE3A/E6-AP regulates cell proliferation by promoting proteasomal degradation of p27[J].Neurobiol Dis,2009,36(1):26-34.

[17] Sui L,Dong Y,Watanabe Y,et al.Clinical significance of Skp2 expression,alone and combined with Jabl and p27 in epithelial ovarian tumors[J].Oncol Rep,2006,15(4):765-771.

[18] 吳 芃,鄭少斌.p27kip1在腎癌中的表達(dá)及臨床意義[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(8):1883-1886.

[19] 鄧榮輝,周慧霞.乳腺癌中p27表達(dá)及其臨床意義[J].實(shí)用癌癥雜志,2009,24(2):203.

[20] 魏茂富,盧義生.p27在大腸癌、大腸腺瘤及正常大腸粘膜中的表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2009,47(7):113-114.

[21] 李朝爭(zhēng),張祥宏.膀胱癌中Skp2與p27表達(dá)的臨床意[J].中華腔鏡泌尿外科雜志,2009,3(3):253-255.

[22] Polyak K,Kato J Y,Sherr C J,et al.p27Kip1,acyclincdk inhibitorlink stransforming growth faetorbeta and contact inhibitor of cell cycle alx est[J].Am J Pathol,2001,115(1):32-38.

[23] Li X,Hui A M,Shi Y Z,et al.Deregulation of G1/S transition is a common event in carcinoma of the ampulla of vater[J].Hepatogastroenterology,2002,49(47):1239.

[24] Rowley P T,Tabler M.T domexme inhibitors[J].Anticancer Res,2000,20(6):4419.