郭廣君，呂素芳，肖躍強，畢研麗，魏 鳳，，沈志強，，丁 壯

（1.吉林大學畜牧獸醫(yī)學院，吉林長春 130062；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預防獸醫(yī)學與動物生物技術重點實驗室，山東濱州 256600；3.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600）

偽狂犬病是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）也稱為豬I型皰疹病毒（Suis herpesvirus 1）或 Aujeszky＇s病毒，它與人單純皰疹病毒（HSV－1、HSV－2）和水痘帶狀皰疹病毒（VZV）、牛皰疹病毒1型（BHV－1）、馬皰疹病毒1型（EHV－1）以及雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）同屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）的α皰疹病毒亞科，其宿主范圍很廣，能有效感染除高級靈長類外的哺乳動物和一些禽類，豬是其自然宿主和傳染源之一。PRV能引起多種家畜及野生動物以發(fā)熱、奇癢（除豬外）和腦脊髓炎為主要癥狀的急性傳染病，并可在豬體內(nèi)建立潛伏感染。

隨著免疫學與分子生物學技術日臻完善，豬偽狂犬病的現(xiàn)代疫苗研究有了長足的發(fā)展，相關的血清學方法和分子生物學診斷方法也不斷完善，本文就近年來針對豬偽狂犬病病毒的檢測方法做一綜述。

1 血清學方法

1.1 中和試驗

中和試驗（neutralization test，NT）又稱微量血清 中 和 試 驗 （mircoserum neutralization test，MSNT），作為病毒檢測的經(jīng)典方法，是世界上多數(shù)國家診斷PR的法定方法之一。將標準病毒株與連續(xù)倍比稀釋的等量血清混勻后，37℃中和1h，接種在96孔微量培養(yǎng)板上的單層豬腎繼代細胞（PK－l5）或雞胚成纖維細胞，置37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)觀察細胞病變（CPE），以能完全中和病毒的血清最高稀釋度的倒數(shù)為該血清的中和效價，中和效價大于或等于1∶2的判為陽性。方六榮等［1］用MSNT進行了PRV的血清學調查。通過監(jiān)測中和指數(shù)和中和效價，發(fā)現(xiàn)MSNT的特異性很強，但敏感性較低。如果延長抗原與血清的孵育時間，尤以補體存在時，可使其敏感性增高。NT有較高靈敏度，是一種常用的診斷方法。由于該法操作繁瑣，工作量大，且受技術、細胞等條件限制，給臨床應用帶來一定的困難。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗 （enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）具有快速、簡便、特異性強、敏感性高的優(yōu)點，可用于大批量樣品的檢測，IgM－ELISA還可早期檢測。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其作為診斷豬PR的首選血清學方法。美國也將ELISA作為PR的3種法定診斷方法之一。

隨著近年來基因工程缺失疫苗的研制成功，我國陸續(xù)建立了針對野毒與疫苗毒株的鑒別診斷方法。唐勇［2］在克隆表達的基礎上建立了gG－LAT、gG－ELISA和gE－LAT、gE－ELISA。結果表明，gGLAT和gG－ELISA特異性強、敏感性高，可用于區(qū)分gG基因缺失疫苗活苗免疫豬與自然感染野毒的血清學陽性豬；gE－LAT和gE－ELISA特異、敏感且重復性好，能顯著區(qū)分gE基因缺失疫苗免疫豬血清和野毒感染豬血清，可用于豬偽狂犬病的鑒別診斷。汪招雄等［3］以豬偽狂犬病病毒（PRV）Ea株特異性單克隆抗體576株為捕獲抗體，純化的抗PRV IgG為檢測抗體，建立了檢測PRV抗原的雙抗體夾心ELISA方法。結果表明，雙抗體夾心間接ELISA方法具有敏感性高、特異性強和重復性好的特點，可廣泛應用于動物組織中PRV的檢測。Gut M 等［4］構建了直接競爭 ELISA （gE／gI－ELISA），試驗證明gE／gI ELISA比gE－ELISA的敏感性和特異性更強，還可用于檢測感染2周齡的早期感染豬血清中的抗體。Gut M 等［5］構建了直接夾心BacgB ELISA，結果證明此法具有較高的特異性和敏感性，最早可以檢測感染7d后豬血清中的gB抗體。感染豬體內(nèi)可以檢測到母源抗體，還可用于檢測包括gE缺失在內(nèi)的疫苗毒與自然感染毒。Ao J Q等［6］將畢赤酵母表達的gE蛋白作為包被抗原，建立了間接gE－ELISA方法，與商業(yè)的gE－ELISA方法相符程度無顯著差異（P＞0.05）。羅飛［7］以在大腸埃希菌中高效表達的偽狂犬病毒gB重組蛋白作為抗原，以辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗豬IgG為二抗，建立了針對血清gB抗體的間接gBELISA，該方法敏感性和特異性分別為75%（27／36）和80.7%（67／83），符合率為79%（94／119）。

1.3 乳膠凝集試驗

乳膠凝集試驗（latex agglutination test，LAT）利用抗原抗體特異性結合的性質，先用乳膠包被抗原，再與相應血清反應，如幾分鐘內(nèi)發(fā)生凝集，可判定有PRV感染。唐勇［8］在克隆表達的基礎上建立了 gG－LAT、gG－ELISA 和 gE－LAT、gE－ELISA。結果表明，gG－LAT和gG－ELISA特異性強、敏感性高，可用于區(qū)分gG基因缺失疫苗活苗免疫豬與自然感染野毒的血清學陽性豬；gE－LAT 和gEELISA特異、敏感且重復性好，能顯著區(qū)分gE基因缺失疫苗免疫豬血清和野毒感染豬血清，可用于豬偽狂犬病的鑒別診斷。美國已經(jīng)有商品化的LAT試劑盒供臨床使用，LAT操作簡單、方便、快速，且敏感性高、特異性強，適用于疫病監(jiān)測或流行病學調查，以及種豬群檢疫凈化陽性豬初次篩選。

1.4 血凝試驗與血凝抑制試驗

吳平等［9］用單克隆抗體致敏綿羊紅細胞建立了反向間接血凝抑制試驗（HI），與MSNT符合率為94%。廖文軍等［10］以純化的抗人紅細胞單鏈抗體（ScFv）－PRV gE蛋白雙功能融合蛋白為抗原，建立了檢測豬偽狂犬病病毒gE抗體的紅細胞凝集試驗。與美國進口的PRV抗體檢測gE－ELISA診斷試劑盒比較，陰、陽性檢出符合率均為100%。紅細胞凝集試驗檢測方法具有操作簡便、敏感性和特異性較高的特點，可用于PRV野毒感染的快速篩查。

1.5 膠體金免疫層析

白靜等［11］利用PCR技術從PRV基因組中克隆gE抗原表位基因，將其插入到載體pET－22b（＋）中，構建成原核表達質粒，并在E.coliBL21（DE3）中誘導表達，表達產(chǎn)物純化后作為抗原，結合膠體金標記技術，應用雙抗原夾心法于國內(nèi)首先建立了豬PRV gE抗體檢測的免疫層析試紙條。該方法操作簡單、靈敏度高、特異性好，適合豬偽狂犬病的臨床診斷。廖文軍等［12］以純化的抗人紅細胞單鏈抗體（ScFv）－PRV gE蛋白雙功能融合蛋白為診斷抗原和膠體金標記物，以羊抗豬IgG包被硝酸纖維膜作為質控帶，制作檢測PRV gE抗體的雙抗原膠體金試紙條。試紙條在室溫保存6個月，其特異性和敏感性沒有明顯變化；與美國IDEXX和法國LSI gE－ELISA抗體檢測診斷試劑盒檢測結果比較，1 164份豬血清的符合率均為90.55%。制備的膠體金試紙條具有操作簡便、敏感性和特異性較高的特點，可用于PRV野毒感染的快速篩查。

2 分子生物學方法

2.1 核酸探針

郭萬柱等［13］用斑點雜交法應用32P標記PRV全基因組DNA和重組質粒作探針檢測細胞培養(yǎng)物中的PRV－DNA，均能檢測10pg的PRV－DNA且有較高特異性。王琴等［14］以非放射性生物素標記DNA探針檢測偽狂犬病病毒，且與郭萬柱報道的結果一致。魏偉等［15］用光敏生物素標記PRV特異性糖蛋白GP50克隆重組顆粒PUP作為探針，檢測試驗感染乳豬15頭份，證明通過PCR和分子克隆技術制備的PRV特異性糖蛋白基因片段的光敏生物探針能有效地用于檢測偽狂犬病病毒。劉志杰等［16］利用PCR技術擴增gE基因片段，制備了地高辛標記的gE基因核酸探針，特異性好，對PRV野毒的最低檢出量為4pg，敏感性高，與PCR檢測結果一致，表明該核酸探針可用于豬偽狂犬病野毒感染的臨床診斷。

2.2 基因芯片

張煥容等［17－18］對偽狂犬病病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）和日本腦炎病毒（JEV）檢測基因芯片的制備及該芯片的檢測技術進行了研究。取其中13個靶基因PRV gB、gG、TK和gE，PPV NS2、NS3、VP1和VP2以及JEVC、PrM／M、E、NS1和NS5制備PRV、PPV和JEV檢測基因芯片，結果制備的芯片質量好，檢測的靈敏度為3pg／μL，特異性強，芯片可重復使用，芯片批間重復性好。該芯片可同時檢測PRV、PPV和JEV，可區(qū)分偽狂犬病病毒野毒和基因缺失疫苗毒。符芳等［19］將豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬細小病毒（PPV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV－2）的特異cDNA片段作為探針點制于氨基修飾的玻片上，以這5種細胞毒的核酸作為模板，建立了基因芯片探針檢測方法。結果顯示，該芯片探針可以特異地與Cy3標記的這5種靶物結合。用該基因芯片對100份現(xiàn)場采集的豬全血樣品進行檢測，檢出PRRSV陽性樣品26份，PCV－2陽性樣品47份，PRRSV和PCV－2混合感染陽性樣品17份，PPV陽性樣品5份，PRV陽性樣品2份，CSFV陽性樣品20份。表明研制的cDNA芯片探針可以特異地檢測這5種豬病病毒，具有良好的診斷應用前景。

2.3 PCR方法

2.3.1 多重PCR PCR方法以其快速、敏感、易于操作等優(yōu)點在近年來被廣泛應用，檢測PRV與其他豬病毒病的多重PCR方法也相繼建立。潘群興等［20］建立了一種同時檢測豬圓環(huán)病毒2型（PCV－2）、豬細小病毒（PPV）及豬偽狂犬病病毒（PRV）疫苗株與野毒株的多重PCR方法。該方法敏感性較高，特異性好，對臨床上進行這3種疾病的鑒別診斷和混合感染的檢測具重要意義。曲光剛等［21］建立了PRV、PPV雙重PCR檢測方法，具有良好的特異性和敏感性，省時、省力、快速、高效、敏感。岳豐熊［22］建立了一種能夠同時檢測PCV－2、PPV、PRV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的多重PCR方法（mPCR）。結果表明，該方法具有很好的特異性和敏感性，對臨床上PCV－2、PPV、PRV、PRRSV的鑒別診斷以及這4種病毒的流行病學調查具有重要意義。Huang C等［23］建立了快速檢測PRV、PPV、PCV－1和PCV－2的多重PCR方法，通過不同PCR組合可以從淋巴結、肺臟、脾臟、扁桃體等組織檢測到一種或多種病毒，敏感性和特異性較高，可作為分子生物學診斷的常用方法。Lee C S等［24］建立了可同時檢測豬體內(nèi)偽狂犬病病毒、細胞巨化病毒和豬圓環(huán)病毒的多重PCR方法。Yue F等［25］建立了快速檢測豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒、豬偽狂犬病病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重PCR方法。多重PCR將成為分子生物學檢測和流行病學調查的常用方法。

2.3.2 實時定量 PCR 趙麗等［26－27］根據(jù)豬偽狂犬病病毒gE基因保守序列，建立了實時定量熒光PCR方法。結果表明，該方法具有快速、特異、敏感、可定量，并可同時檢測大量樣品等優(yōu)點。呂建強等［28］根據(jù)GenBank中登錄的偽狂犬病病毒gD基因序列，選擇高度保守區(qū)域設計引物和TaqMan熒光探針，通過對實時熒光PCR反應條件進行優(yōu)化，建立了用于檢測偽狂犬病病毒的實時熒光PCR方法，靈敏性試驗發(fā)現(xiàn)，其最低檢測限可達1.42 pg／μL的總DNA，其敏感度比PCR至少高10倍。李明鳳等［29］利用PCR技術擴增PRV gH基因的187bp片段，建立了SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測方法，該方法具有特異、敏感、快速、定量、重復性好等優(yōu)點，可用于臨床PRV感染的檢測。Ma W等［30］根據(jù)PRV gB和gE基因分別設計引物和探針，建立了快速檢測區(qū)分偽狂犬病毒野毒與基因缺失疫苗毒的實時熒光定量PCR方法，能快速、特異檢測感染和潛伏感染野豬體內(nèi)的PRV。Zhao L等［31］根據(jù)PRV gH，gE基因設計兩對引物及相應的探針，建立了區(qū)分偽狂犬病野毒與疫苗毒的熒光定量PCR診斷方法，結果表明，建立的FQ－PCR方法快速、敏感、特異、精確，可廣泛用于PRV野毒檢測，為早期快速診斷和定量分析PRV的感染程度奠定了基礎。Tombácz D 等［32］建立了實時定量RT－PCR方法，從感染PK－15細胞中提取PRV全基因組檢測RNA，以一種新的方式計算相對表達量，通過表達動力學比較不同的PRV基因并進行分類，首次通過qRT2－PCR方法進行基因表達研究皰疹病毒全基因組。

2.3.3 LAMP方法 環(huán)介導等溫擴增（loop－mediated isothermal amplification）是一種新興的快速擴增技術，非常適合于現(xiàn)場檢測。自建立以來，其在反應速度、產(chǎn)物檢測和引物設計等許多方面又得到了進一步的改進和發(fā)展，使其性能更優(yōu)異，用途更廣泛。En F X 等［33］根據(jù) PRV 的 DNA－結 合 蛋 白（DBP）基因設計6條引物，建立了檢測PRV的LAMP方法。最低檢測量達10fg DNA，比普通PCR靈敏度高100倍～1 000倍，而且特異性好。采取5份臨床樣品同時進行LAMP和PCR檢測，相關性高。Zhang C F等［34］根據(jù)gE基因設計一組引物檢測野毒株，根據(jù)gG或gE基因設計另一組引物檢測gE－疫苗毒和野毒，建立了用于快速檢測區(qū)別偽狂犬病野毒與基因缺失疫苗毒的LAMP方法。結果表明，比普通PCR靈敏100倍～1 000倍，具有特 異 性，PPV、PCV－1、PCV－2、PRRSV、CSFV、TGEV、PEDV等豬的病毒未擴增出。LAMP方法因其敏感性、特異性、操作簡單，將成為早期快速鑒別區(qū)分PRV gE缺失疫苗與自然感染野毒的方法。

4 展望

對病原快速而準確的檢測是防控當今威脅畜牧業(yè)各類傳染病的關鍵措施。目前用于PRV感染的診斷方法很多，各有優(yōu)缺點。血清學檢測手段，尤其是研制成功的LAT和針對主要抗原蛋白gE、gB、gD建立的ELISA試劑盒操作簡單、方便，不需要使用昂貴復雜的儀器，可以在基層組織中廣泛應用。特別是近年來隨著單抗技術和基因擴增技術的日臻完善和改進，膠體金試紙條研制和LAMP技術方法的建立與應用使基層現(xiàn)場直觀的檢測成為可能。

分子生物學方法靈敏度高、特異性好，隨著條件的完善將會越來越廣泛應用。多重PCR和套式PCR的應用提高了檢測疾病的特異性和敏感性，可以用于大批樣品的檢查和流行病學調查；而核酸探針方法靈敏度高，可以達到pg級，是目前靈敏度最高的檢測方法，但是其試驗操作步驟較為復雜而繁瑣，可以用于實驗室檢測和判定。當然，無論哪一種方法都不能徹底解決所有的問題，可以根據(jù)檢測的目的和要求，選擇最適宜的檢測方法或將幾種檢測方法組合起來應用，做到早發(fā)現(xiàn)，力爭從根本上解決該病的防控問題。

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