宋軍科，才學(xué)鵬，駱學(xué)農(nóng)，林 青，竇永喜，于三科＊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省動(dòng)物寄生蟲(chóng)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046）

半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteases，CP）約為21ku～30ku，在pH 4～6.5時(shí)水解活性最高［1］。CP在生物進(jìn)化過(guò)程中是非常保守的酶系，不同的生物物種之間的半胱氨酸蛋白酶有一定的相似性，同一物種的不同半胱氨酸蛋白酶也有結(jié)構(gòu)相似的現(xiàn)象，這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相似的酶構(gòu)成了一個(gè)蛋白酶家族，稱(chēng)之為caspase（cysteine aspartic acic specific protease）家族。在1879年第一個(gè)純化和確認(rèn)的半胱氨酸蛋白酶取自番木瓜果（carica papaya），因而命名為木瓜蛋白酶（papain）。以后發(fā)現(xiàn)許多與木瓜蛋白酶有相似序列的蛋白酶，統(tǒng)稱(chēng)為木瓜蛋白酶樣蛋白酶（papain like protease）或CA蛋白酶族。寄生蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶大多屬于CA族內(nèi)的C1族（組織蛋白酶B cathepsin B和組織蛋白酶L樣蛋白酶cathepsin L－like）和C2族（鈣激活蛋白酶樣蛋白酶）［2］。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)CP的種類(lèi)、來(lái)源、結(jié)構(gòu)及其功能進(jìn)行了多方面的研究，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到其廣泛分布于從病毒至脊椎動(dòng)物的生物體中，當(dāng)然動(dòng)物和人的寄生蟲(chóng)也會(huì)不例外，這些蛋白酶已經(jīng)被證實(shí)在寄生蟲(chóng)的發(fā)育和生存過(guò)程中發(fā)揮著各種各樣重要的作用。經(jīng)過(guò)許多科研工作者過(guò)去幾十年在寄生性蠕蟲(chóng)和原蟲(chóng)方面的研究，揭示了這些由寄生蟲(chóng)分泌的蛋白酶不僅是寄生蟲(chóng)入侵組織的因子之一，其也可能在寄生蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)、免疫逃避和蛻皮等方面有重要作用［3－5］。因此，寄生蟲(chóng)的半胱氨酸蛋白酶已經(jīng)在研發(fā)新的抗寄生蟲(chóng)藥物和抗寄生蟲(chóng)疫苗的目標(biāo)方面得到了關(guān)注。

1 寄生蟲(chóng)半胱氨酸的來(lái)源及存在的部位

在寄生生物中存在有分泌的蛋白水解酶，說(shuō)明這些酶對(duì)于寄生蟲(chóng)進(jìn)行各種必需的機(jī)制是非常需要的。組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶已經(jīng)在很多種寄生蟲(chóng)體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，而且組織蛋白酶L在寄生蟲(chóng)的所有發(fā)育階段都會(huì)被分泌。寄生蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶的分泌或存在的部位在不同蟲(chóng)種以及同一蟲(chóng)種不同蟲(chóng)期均有差異。肝片吸蟲(chóng)，衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)的半胱氨酸蛋白酶在腸上皮細(xì)胞中合成，集中于分泌小泡，通過(guò)分泌小泡釋放到腸腔中［6－7］。巴西日本圓線(xiàn)蟲(chóng)的半胱氨酸蛋白酶活性不僅存在于蟲(chóng)體抽提物中，也存在于其排泄分泌物中。曼氏血吸蟲(chóng)的組織蛋白酶B和L1樣半胱氮酸蛋白酶存在于成蟲(chóng)皮層（尤其是雄蟲(chóng)的腹側(cè)皮層）和盲腸的腸表皮細(xì)胞［8］。瘧原蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶存在于胞內(nèi)酸性食物泡中［9］。

寄生蟲(chóng)的半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲(chóng)的多個(gè)部位及各個(gè)發(fā)育階段均可產(chǎn)生或存在，目前研究人員所獲得的半胱氨酸蛋白酶來(lái)源一方面來(lái)自于蟲(chóng)體組織提取物或分泌代謝產(chǎn)物，而另一方面則應(yīng)用分子生物學(xué)方法通過(guò)對(duì)半胱氨酸蛋白酶的基因進(jìn)行克隆，表達(dá)而獲得。

2 半胱氨酸蛋白酶的分泌機(jī)制

許多感染哺乳動(dòng)物宿主的單細(xì)胞寄生蟲(chóng)和多細(xì)胞寄生蟲(chóng)產(chǎn)生多種蛋白酶，其中一些是通過(guò)分泌方式產(chǎn)生的。組織蛋白酶L在寄生蟲(chóng)的所有發(fā)育階段都會(huì)被分泌，片形吸蟲(chóng)排泄分泌物（excretion／secretion，E／S）的一個(gè)重要組成部分就是有一類(lèi)半胱氨酸蛋白酶，它們的分子量大小在26ku～30ku之間，這些酶通過(guò)吸蟲(chóng)成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)的腸表皮分泌。免疫細(xì)胞化學(xué)研究說(shuō)明這種酶被做為無(wú)活性的前酶—前組織蛋白酶L貯存于腸表皮上皮細(xì)胞中，再通過(guò)自身催化前組織蛋白酶L表現(xiàn)出活性，然后分泌到寄生蟲(chóng)腸內(nèi)腔中的酸性環(huán)境中，在此有活性的蛋白酶起到消化食物的功能［10］。由于寄生性吸蟲(chóng)的腸管為盲腸，因此，未消化產(chǎn)物靠回流到口孔（約每3h一次）排出。通過(guò)這種方式，有活性的成熟組織蛋白酶L被定期地釋放出來(lái)，以充分發(fā)揮其作用。組織蛋白酶L半胱氨酸蛋白酶在吸蟲(chóng)成蟲(chóng)體內(nèi)被大量合成（每成蟲(chóng)每小時(shí)0.5μg／～1.0μg），從分泌小泡內(nèi)物質(zhì)的合成到釋放到腸內(nèi)腔中的更新率是非?？斓模蠹s每小時(shí)一次［11］。

3 半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲(chóng)免疫逃避、營(yíng)養(yǎng)獲得與移行方面的研究

3.1 半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲(chóng)免疫逃避中的作用

當(dāng)研究發(fā)現(xiàn)肝片吸蟲(chóng)E／S產(chǎn)物能將IgG重鏈切割的用作以后，人們認(rèn)識(shí)和預(yù)測(cè)到組織蛋白酶在宿主免疫免疫逃避中的作用。認(rèn)為這些酶可能會(huì)阻止抗體活性效應(yīng)功能，比如可以阻止補(bǔ)體結(jié)合在移行中的吸蟲(chóng)附近，為蟲(chóng)體免受免疫攻擊提供保護(hù)。體外試驗(yàn)也證實(shí)了嗜酸性粒細(xì)胞不能進(jìn)行或者不能維持抗體介導(dǎo)對(duì)幼蟲(chóng)階段包囊的結(jié)合能力，寄生蟲(chóng)在體內(nèi)分泌的這些酶可以保護(hù)它們免受宿主免疫反應(yīng)的破壞。另一方面，寄生蟲(chóng)通過(guò)自身分泌的蛋白酶加速其皮層和組織的更新與代謝以阻止宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別［12］。另外，一些寄生蟲(chóng)的半胱氨酸蛋白酶也發(fā)現(xiàn)有通過(guò)誘導(dǎo)IL－4抑制Th1免疫的作用。Machado D C等［13］證明了這些蛋白酶甚至在沒(méi)有特異性免疫球蛋白存在的情況下，也可活化肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒并分泌IL－4。缺乏半胱氨酸蛋白酶的墨西哥利什曼原蟲(chóng)能在Balb／c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)Th1免疫反應(yīng)，小鼠也很少遭受感染，且不能使小鼠生長(zhǎng)受到損害［14］。片形吸蟲(chóng)在牛、羊和人等許多宿主體內(nèi)可導(dǎo)致一種慢性肝病。與其他寄生蟲(chóng)一樣，肝片吸蟲(chóng)產(chǎn)生一種嚴(yán)重的Th2反應(yīng)，并且能抵御宿主免疫反應(yīng)的持續(xù)攻擊，在它的終末宿主體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存活［10］。

片形吸蟲(chóng)感染過(guò)程期間，在哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)發(fā)育的寄生蟲(chóng)的所有階段中都有組織蛋白酶L的釋放，其中穿過(guò)腸壁的新感染的包囊幼蟲(chóng)階段也可釋放此蛋白酶［15］。目前研究認(rèn)為，肝片吸蟲(chóng)通過(guò)利用誘導(dǎo)的半胱氨酸蛋白酶對(duì)CD4進(jìn)行切割，這可能是肝片吸蟲(chóng)用來(lái)抑制淋巴細(xì)胞增殖的機(jī)制之一，這種機(jī)制在綿羊體內(nèi)有助于蟲(chóng)體逃避對(duì)宿主的免疫系統(tǒng)并有助于感染的建立。已經(jīng)證實(shí)了肝片吸蟲(chóng)的感染能抑制 Th1反應(yīng)［10］。

3.2 半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲(chóng)獲取營(yíng)養(yǎng)與移行中的作用

從宿主組織降解開(kāi)始，攝食與移行可能就不會(huì)被分開(kāi)，在寄生蟲(chóng)移行期間，宿主組織降解物能提供給寄生蟲(chóng)用以更進(jìn)一步消化和吸收的物質(zhì)。半胱氨酸蛋白酶主要的生化性質(zhì)還是其蛋白水解作用。正是因?yàn)檫@個(gè)性質(zhì)，使得該酶成為某些寄生蟲(chóng)的主要“消化酶”。有人通過(guò)捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)的體外培養(yǎng)試驗(yàn)，表明了該蟲(chóng)體分泌的半胱氨酸蛋白酶可抑制綿羊紅細(xì)胞的凝集，水解血紅蛋白、纖維蛋白原、膠原蛋白和IgG，而半胱氨酸蛋白酶對(duì)IgG的水解主要是作用于絞鏈區(qū)使其降解［16］。從衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)囊蚴純化出的酸性半胱氨酸蛋白酶能降解人血清白蛋白、免疫球蛋白、補(bǔ)體成分等多種人體蛋白質(zhì)［17］。在曼氏血吸蟲(chóng)中，在盲腸內(nèi)壁的腸表皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種組織蛋白酶L樣半胱氨酸蛋白酶，此酶可能涉及白蛋白和血紅蛋白的降解，以此作為血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源［4，18］。而有棘顎口線(xiàn)蟲(chóng)組織蛋白酶 L1（Gnathostomaspinigerumcathepsin L1，GsCL1）在腸中的定位，說(shuō)明了此蛋白酶對(duì)有棘顎口線(xiàn)蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)（L3）攝入的宿主蛋白有降解作用［19］。

半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲(chóng)侵入宿主的過(guò)程中也起著重要的作用。通過(guò)捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)結(jié)締組織降解能力的研究，發(fā)現(xiàn)該蟲(chóng)分泌的半胱氨酸蛋白酶能夠降解結(jié)締組織的主要成分，而對(duì)宿主結(jié)締組織的降解有利于對(duì)宿主組織的破壞和易于蟲(chóng)體的侵入［20］。肝片吸蟲(chóng)組織蛋白酶L半胱氨酸蛋白酶2（Fasciolahepaticacathepsin L cysteine proteinases，F(xiàn)hCL－2）以產(chǎn)生一種纖維蛋白凝塊的方式切割纖維蛋白原［21］。Berasain P等［22］證明了 FhCL－1和FhCL－2能降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜分子以促進(jìn)寄生蟲(chóng)自身移行。

4 其他方面

4.1 半胱氨酸蛋白酶對(duì)寄生蟲(chóng)生殖力的影響

一種組織蛋白酶被免疫定位于肝片吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的梅氏腺中［23］。梅氏腺是一簇細(xì)胞，它們能夠分泌催化蟲(chóng)卵卵殼的形成。用4.8mg的E／S產(chǎn)物（含1300μg半胱氨酸蛋白酶）免疫水牛后，證明了在糞便中的大片吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵數(shù)明顯下降［10］。因此，推測(cè)接種后的水牛體內(nèi)，梅氏腺半胱氨酸蛋白酶L是免疫反應(yīng)的目標(biāo)，它可導(dǎo)致卵殼合成受到干擾。對(duì)吸蟲(chóng)自身生殖的影響，可依次對(duì)從終末宿主到中間宿主的傳播各環(huán)節(jié)施加影響。

4.2 半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲(chóng)脫包囊、脫鞘和羽化中的作用

原蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物的羽化，包囊破裂，甚至包囊形成都需要半胱氨酸蛋白酶的參與。在衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)中，半胱氨酸蛋白酶涉及宿主腸腔內(nèi)囊蚴的脫囊。L3期美洲板口線(xiàn)蟲(chóng)脫鞘和曼氏血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵孵化都需要半胱氨酸蛋白酶，盤(pán)尾絲蟲(chóng)、犬惡絲蟲(chóng)和彭亨絲蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶抑制劑阻滯L3幼蟲(chóng)期蛻皮。研究發(fā)現(xiàn)，惡性瘧原蟲(chóng)滋養(yǎng)體（或裂殖體）的可溶性胞體提取物中的半胱氨酸蛋白酶能夠從人紅細(xì)胞膜錨蛋白的C端裂解掉一個(gè)155ku肽段，而錨蛋白是紅細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)蛋白，高親和性連接于紅細(xì)胞定形素—肌動(dòng)蛋白，形成膜骨架網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。降解后的錨蛋白與細(xì)胞膜的連接減弱，從而降低了紅細(xì)胞膜骨架的穩(wěn)定性，使其脆性增加，有利于蟲(chóng)體的人侵和釋放。此前也有人從伯氏瘧原蟲(chóng)裂殖體和裂殖子的頂端復(fù)合體中鑒定出了68ku的半朧氨酸蛋白酶，該酶可能在蟲(chóng)體的人侵中具有一定作用。

這些情況說(shuō)明了半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲(chóng)的發(fā)育過(guò)程中是有重要的作用。

4.3 半胱氨酸蛋白酶的免疫原性

半胱氨酸蛋白酶在不同的蟲(chóng)種和同一蟲(chóng)種不同期，其化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量和性質(zhì)都不盡相同，其免疫原性也存在著種特異性和期特異性。從肝片吸蟲(chóng)成蟲(chóng)排泄分泌物中純化出兩種半胱氨酸蛋白酶（Fasl和Fas2），經(jīng)試驗(yàn)分析顯示它們是免疫優(yōu)勢(shì)抗原，可被肝片吸蟲(chóng)病患者血清識(shí)別，敏感性和特異性均較高［20］。曼氏迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴分泌的半胱氨酸蛋白酶（分子質(zhì)量分別為21，27和53ku）能夠引起宿主特異性IgE抗體反應(yīng)。由此可見(jiàn)，寄生蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶具有較強(qiáng)的免疫原性。利用此免疫原性，可將半胱氨酸蛋白酶用于寄生蟲(chóng)病的免疫診斷和疫苗的研制［24，25］。

5 展望

目前隨著對(duì)半胱氨酸蛋白酶的發(fā)現(xiàn)以及其結(jié)構(gòu)和功能研究的深入，寄生蟲(chóng)的半胱氨酸蛋白酶也受到越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注。對(duì)它的研究不僅揭開(kāi)了寄生蟲(chóng)與宿主相互作用的機(jī)制，也給寄生蟲(chóng)病的診斷與防治開(kāi)辟了新的思路，給目前化學(xué)治療所引起的越來(lái)越嚴(yán)重的耐藥性問(wèn)題的解決帶來(lái)了希望。如將半胱氨酸蛋白酶作為治療寄生蟲(chóng)化學(xué)治療的新靶點(diǎn)，利用相應(yīng)的特異性抑制物來(lái)抑制寄生蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶的活性，阻斷寄生蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)、免疫逃避、侵入及對(duì)宿主的損害作用，從而達(dá)到治療寄生蟲(chóng)病的目的，在這個(gè)領(lǐng)域已經(jīng)開(kāi)展了許多相關(guān)的研究。相信今后半胱氨酸蛋白酶將會(huì)得到更加廣泛的研究和應(yīng)用。

［1］Grzonka Z，Jankowska E，Kasprzykowski F，et a1.Structural studies of cysteine proteaseand their inhibitors［J］.Acta Biochim Pol，2001，48：1－20.

［2］Kang J M，Bahk Y Y，Cho P Y，et al.A family of cathepsin F cysteine proteases ofClonorchissinensisis the major secreted proteins that are expressed in the intestine of the parasite［J］.Mol Biochem Parasitol，2009，170（1）：7－16.

［3］Park H，Kim S I，Hong K M，et al.Characterization and classi－fication of five cysteine proteinases expressed byParagonimuswestermaniadult worm ［J］.Exp Parasitol，2002，102（3－4）：143－149.

［4］Estrela A，Seixas A，Termignoni C.A cysteine endopeptidase from tick（Rhipicephalus（Boophilus）microplus）larvae with vitellin digestion activity ［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2007，148（4）：410－416.

［5］Guiliano D B，Hong X，McKerrow J H，et al.A gene family of cathepsin L－like proteases of filarial nematodes are associated with larval molting and cuticle and eggshell remodeling ［J］.Mol Biochem Parasitol，2004，136：227－242.

［6］Pinlaor P，Kaewpitoon N，Laha T，et al.Cathepsin F cysteine protease of the human liver fluke，Opisthorchisviverrini［J］.PLoS Negl Trop Dis，2009，3（3）：e398.

［7］言 慧.衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶基因的克隆與表達(dá)［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：寄生蟲(chóng)病分冊(cè)，2002，29：84.

［8］Brady C P，Dowd A J，Brindley P J，et al.Recombinant expression and localization of Schistosoma mansoni cathepsin L1 support its role in the degradation of host hemoglobin［J］.Inf and Immunity，1999，67（1）：368－374.

［9］Gluzman I Y，F(xiàn)rancis S E，Oksman A，et al.Order and specificity of thePlasmodiumfalciparumhemoglobin degradation pathway［J］.J Clin Invest，1994，93：1602－1608.

［10］Dixita A K，Dixitb P，Sharmac R L.Immunodiagnostic／protective role of cathepsin L cysteine proteinases secreted byFasciolaspecies［J］.Vet Parasitol，2008，154：177－184.

［11］Collins P R，Stack C N，O＇Neill S M，et al.Cathepsin L1，the major protease involved in liver fluke（Fasciolahepatica）virulence［J］.J Biol Chem，2004，279：17038－17046.

［12］McKerrow J H，Caffrey C，Kelly B，et al.Proteases in parasitic diseases［J］.Annu Rev Pathol，2006，1：497－536.

［13］Machado D C，Horton D，Harrop R，et al.Potential aller－gens stimulate the release of mediators of the allergic response from cells of mast cell lineage in the absence of sensitization with antigen－specific IgE［J］.Eur J Immunol，1996，26：2972－2980.

［14］Alexander J，Coombs G H，Mottram J C，et al.Leishmania mexicanacysteine proteinase－deficient mutants have attenuated virulence for mice and potentiate a Th1response［J］.J Immunol，1998，161：6794－6801.

［15］Harmsen M M，Cornelissen J B W J，Buijs H E，et al.Identification of a novelFasciolahepaticacathepsin L protease containing protective epitopes within the propeptide［J］.Int J Parasitol，2004，34：675－682.

［16］王英.半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲(chóng)與宿主的相互關(guān)系中的作用［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：寄生蟲(chóng)學(xué)分冊(cè)，2001，28（4）：145－149.

［17］Park H，Kim S I，Hong K M，et al.Characterization and classification of five cysteine proteinases expressed byParagonimuswestermaniadult worm ［J］.Exp Parasitol，2002，102（3－4）：143－149.

［18］Dahl E L，Rosenthal P J.Biosynthesis，localization and processing of falcipain cysteine proteases ofPlasmodiumfalciparum［J］.Mol Biochem Parasitol，2005，139：205－212.

［19］Natthawan K，Pichart U，Nimit M，et al.Identification and characterization of a cathepsin L－like cysteine protease fromGnathostomaspinigerum［J］.Mol Biochem Parasitol，2008，160（2）：129－137.

［20］Na B K，Kim S H，Lee E G，et al.Critical roles for excretory secretory cysteine proteases during tissue invasion ofParagonimuswestermaninewly excysted metacercariae［J］.Cell Microbiol，2006，8：1034－1046.

［21］Dowd A J，McGonigle S，Dalton J P，et al.Fasciolahepaticacathepsin L cleaves fibrinogen and produces a novel type of fibrinogen clot［J］.Eur J Biochem，1995，232：241－246.

［22］Berasain P，Goni F，McGonigle S，et al.Proteinases secreted byFasciolahepaticadegrade extracellular matrix and basement membrane components［J］.J Parasitol，1997，83：1－5.

［23］Wijffles G L，Salvatore L，Dosen M，et al.Vaccination of sheep with purified cysteine proteinases ofFasciolahepaticadecreases worm fecundity［J］.Exp Parasitol，1994，78：132－148.

［24］Dowd A J，Tort J，Roche L，et al.Isolation of a cDNA encodingFasciolahepaticacathepsin L and functional expression inSaccharomycescerevisiae［J］.Mol Biochem Parasitol，1997，88：163－174.

［25］McManus D P，Dalton J P.Vaccines against the zoonotic trematodesSchistosomajaponicum，F(xiàn)asciolahepaticaandFasciolagigantica［J］.2006，133：S43－S46.