劉閏夏，藺 濤，2，韋祖樟，孫利廠，2，陸嘉琦，袁世山＊

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的豬的一種高度接觸性傳染病，該病臨床表現(xiàn)形式多樣，主要為母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸系統(tǒng)疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病首先在美國、荷蘭等地報(bào)道，之后在世界范圍內(nèi)迅速流行，并且成為當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病。1996年，郭寶清等首次在我國境內(nèi)分離到該病原，2006年我國江西、江蘇、安徽等多個(gè)南方省份暴發(fā)了豬“無名高熱病”，經(jīng)研究證實(shí)，引起該病的主要病原為發(fā)生遺傳變異的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒。本文綜述了PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白的研究進(jìn)展。

1 PRRSV基因組和表達(dá)調(diào)控

PRRSV屬于套式病毒目（Nidovirales），動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae），動(dòng)脈炎病毒屬（Arterivirus），同屬的還有馬動(dòng)脈炎病毒（Equine arteritis virus，EAV）、小鼠乳酸脫氫酶升高癥病毒（Lactate dehydrogenase－elevating virus，LDV）和猴出血熱病毒（Simian hemorrhagic fever virus，SHFV）。根據(jù)血清型和遺傳特性的差異，可將PRRSV劃分為2個(gè)基因型，即歐洲（Ⅰ）型（代表株Lelystad virus，LV ）和美洲（Ⅱ）型（代表株 VR－2332），2個(gè)基因型在核酸水平上同源性約為60%。

PRRSV為不分節(jié)段、聚腺苷酸化、有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組長度約為15kb，5＇非翻譯區(qū)（untranslated region，5′UTR）長為189～222核苷酸（nucleotide，nt），3＇UTR長約114nt～151 nt。目前已知含有10個(gè)首尾重疊的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。5′端的2個(gè)最大的ORF1（ORF1a和 ORF1b）占基因組長度的 3／4。ORF1通過程序性－1核糖體移碼（programmed－1 ribosome frame shifting）機(jī)制編碼產(chǎn)生2個(gè)多聚蛋白pp1a和pp1ab，多聚蛋白再經(jīng)過自身編碼的蛋白酶切割產(chǎn)生14個(gè)推測的非結(jié)構(gòu)蛋白，分別為Nsp1a，Nsp1β，Nsp2－6，Nsp7a，Nsp7β及 Nsp8－12，這些非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和拮抗干擾素等過程中起到重要的作用［1］?；蚪M近3′端有8個(gè)開放閱讀框編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)需要通過非連續(xù)性轉(zhuǎn)錄（discontinuous transcription）機(jī)制產(chǎn)生亞基因組 mRNA（subgenomic mRNA，sgmRNA）。PRRSV 5′UTR的3′末端最后6個(gè)堿基為病毒種特異性保守序列（5′－UUAACC－3′），稱 為 前 導(dǎo) 序 列 連 接 位 點(diǎn) （Leader Junction Site，LJS）。這一保守序列同時(shí)存在于基因組下游的每個(gè)ORF之前，每個(gè)下游的5′－UUAACC－3′被相應(yīng)地稱為編碼體序列連接位點(diǎn)（body junction site，BJS）。5′UTR 的 LJS與下游的每個(gè)ORF前的BJS相互配對，從而介導(dǎo)5′UTR與下游序列的非連續(xù)性跳躍連接，稱為“非連續(xù)性轉(zhuǎn)錄”。除ORF7外，mRNA在結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)為多順反子（polycistronic），即每一個(gè)下游ORF序列都存在于上游ORF的mRNA分子中，但是除mRNA2外它們在功能上卻表現(xiàn)出單順反子的特性，即每條mRNA最5′端的基因翻譯產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白，mRNA2因同時(shí)編碼ORF2a和ORF2b，呈現(xiàn)為雙順反子。最新發(fā)現(xiàn)的ORF5a大部分序列與ORF5重疊，它們是否由同一個(gè)mRNA編碼還尚未證實(shí)。

2 PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

已知PRRSV有8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白。GP2a、GP3、GP4和GP5等囊膜糖蛋白分別由ORF2a、ORF3、ORF4和ORF5編碼，非糖基化囊膜E蛋白、ORF5a蛋白、膜基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N分別由ORF2b、ORF5a、ORF6和 ORF7分別編碼［2］。根據(jù)囊膜蛋白在病毒粒子中組成的量，囊膜蛋白可分為主要囊膜蛋白（major enveloped protein）和次要囊膜蛋白（minor enveloped protein），GP5和 M 蛋白是病毒粒子的主要組成部分，稱為主要囊膜蛋白。而GP2a、GP3、GP4和E蛋白在病毒粒子表面的含量相對較少，則稱之為次要囊膜蛋白（minor enveloped protein）。

2.1 次要囊膜蛋白

2.1.1 GP2a GP2a由ORF2編碼，分子質(zhì)量為29 ku～30ku，屬于Ⅰ型整合膜糖蛋白，N端和C端的疏水結(jié)構(gòu)域分別作為信號肽序列和膜錨定序列。GP2有兩個(gè)保守的糖基化位點(diǎn)，Ⅰ型PRRSV位于N173和N179位點(diǎn)，而Ⅱ型PRRSV位于N178和N184位點(diǎn)。在Ⅰ型PRRSV反向操作的基礎(chǔ)上，將這2個(gè)糖基化位點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)突變克隆均能拯救出病毒，說明Ⅰ型PRRSV GP2a的兩個(gè)糖基化位點(diǎn)（N173和N179）對感染性病毒粒子的形成都是非必需的［3］。有趣的是，Ⅱ型PRRSV GP2a的N184位糖基化位點(diǎn)對感染性病毒粒子的產(chǎn)生是必需的，可能該位點(diǎn)在GP2a蛋白的正確折疊或與其它糖基化蛋白的相互作用中起重要作用。但是，值得指出的是，Tian等將Ⅰ型PRRSV的ORF2－ORF4替換到Ⅱ型PRRSV感染性克隆，能夠拯救出嵌合病毒，說明PRRSV的小囊膜蛋白的功能在型間能夠互補(bǔ)，提示Ⅱ型PRRSV的糖基化位點(diǎn)對病毒的感染性是非必需的。作者對GenBank上的GP2a通過序列分析發(fā)現(xiàn)，在Ⅱ型PRRSV自然毒株中，存在著N184位點(diǎn)糖基化位點(diǎn)缺失的分離株（primepac株），暗示著N184位點(diǎn)糖基化對病毒的感染性是非必需的［4］。

2.1.2 E蛋白 小囊膜蛋白E是由ORF2b編碼的一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，由70（Ⅰ型）或73（Ⅱ型）個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為10ku。無潛在的糖基化位點(diǎn)，但N端有肉豆蔻基化位點(diǎn)和酪蛋白Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，研究表明E蛋白豆蔻酰化對病毒的感染性是非必需的，但是能促進(jìn)病毒的增殖［5］。E蛋白含有2個(gè)半胱氨酸（cys48和cys54），但E蛋白不能形成二硫鍵連接的同源二聚體。Lee C等［6－7］報(bào)道稱，E蛋白鑲嵌在病毒囊膜中，可能具有離子通道的作用，能促進(jìn)病毒在感染過程中脫殼完成基因組釋放過程。

2.1.3 GP3 GP3為ORF3編碼的高度糖基化蛋白，分子質(zhì)量為45ku～50ku，含265（Ⅰ型）或254（Ⅱ型）個(gè)氨基酸。GP3是PRRSV各毒株間保守性最差的蛋白之一，在Ⅰ型與Ⅱ型PRRSV毒株間只有55%的氨基酸同源性，而且多數(shù)變異發(fā)生在N末端。Ⅱ型PRRSV GP3的C端比Ⅰ型PRRSV的少12個(gè)氨基酸，而C端又是一個(gè)高變區(qū)，含有兩型特異的抗原表位，可能參與病毒的中和作用。Ⅱ型PRRSV的GP3最初被認(rèn)為是一個(gè)可溶性的分泌蛋白，不屬于結(jié)構(gòu)蛋白的成分。之后的研究證實(shí)Ⅱ型PRRSV的GP3與Ⅰ型PRRSV一樣作為病毒粒子的小囊膜蛋白［8］。

GP3具有7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，這些糖基化位點(diǎn)在歐、美兩型分離株間非常保守。已經(jīng)證實(shí)，GP3的前6個(gè)糖基化位點(diǎn)是確實(shí)存在的，最后一個(gè)潛在位點(diǎn)是未被糖基化的。并且GP3的N42、N50和N131位糖基化位點(diǎn)對病毒粒子的產(chǎn)生是必需的，而其他3個(gè)非必需的糖基化位點(diǎn)影響病毒粒子的生長特性［3］。研究表明，GP3N131糖基化與病毒的免疫逃避有關(guān)，缺失N131糖基化位點(diǎn)，突變對高免血清易感，同時(shí)也能夠激發(fā)豬體產(chǎn)生高水平的中和抗體［9］。

2.1.4 GP4 GP4分子質(zhì)量為31ku～35ku，由183（Ⅰ型）或178（Ⅱ型）個(gè)氨基酸組成，為典型的Ⅰ型跨膜蛋白，包含N端和C端強(qiáng)疏水區(qū)，含有4個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。GP4任意一個(gè)糖基化位點(diǎn)的突變都不影響病毒粒子的拯救，但突變病毒的滴度比親本毒高，可能是更有利于多聚糖蛋白復(fù)合體的形成或突變病毒與細(xì)胞受體結(jié)合。但任意兩個(gè)或更多糖基化位點(diǎn)的突變對病毒都是致死性的。GP4的糖基化位點(diǎn)也影響其與CD163的結(jié)合從而決定病毒粒子能否進(jìn)入宿主細(xì)胞。GP4單個(gè)糖基化位點(diǎn)的突變能夠拯救出感染性病毒粒子，因此認(rèn)為單個(gè)糖基化位點(diǎn)突變的GP4蛋白可以與CD163分子有效結(jié)合，但是突變2個(gè)以上糖基化位點(diǎn)的GP4蛋白不能與CD163分子有效結(jié)合，因此其他糖基化位點(diǎn)對GP4與CD163分子的結(jié)合起重要作用。此外，GP4蛋白在介導(dǎo)與其他糖基化蛋白的相互作用從而形成病毒復(fù)制所必需的多聚蛋白復(fù)合體中發(fā)揮重要功能［3］。

GP2a、GP3和GP4之間通過非共價(jià)結(jié)合形成三聚體，同時(shí)與E蛋白具有相互作用；且GP5與GP4具有強(qiáng)烈的相互作用，GP5與M蛋白通過二硫鍵形成異源二聚體，這些蛋白通過相互作用形成多聚蛋白復(fù)合體，進(jìn)而參與病毒粒子的組裝。GP4與所有的糖基化蛋白相互作用，在GP4存在的情況下，GP2a、GP3可以通過與GP4的互作間接與GP5結(jié)合，因此認(rèn)為GP4是介導(dǎo)多聚蛋白復(fù)合體形成的關(guān)鍵蛋白。此外，GP2a、GP4的糖基化位點(diǎn)不能保護(hù)病毒逃避宿主抗體的中和作用［3］。雖然LV株GP4蛋白具有中和表位，但血清的中和抗體效價(jià)與GP4抗體的出現(xiàn)似乎沒有相關(guān)性，其中和作用也遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于GP5的抗體，因此GP4在誘導(dǎo)中和抗體方面的意義還不明確。

2.1.5 5a蛋白 5a蛋白是最新發(fā)現(xiàn)的在動(dòng)脈炎病毒中普遍存在的第8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，PRRSV的5a蛋白包括46～51個(gè)氨基酸，EAV包括43～64個(gè)氨基酸。ORF5a的大部分序列與ORF5重疊，它們可能由同一個(gè)亞基因組sgmRNA5轉(zhuǎn)錄，通過核糖體移碼機(jī)制表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白。Johnson C R等［2］通過質(zhì)譜分析在高度純化的Ⅱ型PRRSV病毒粒子中檢測到5a蛋白的存在，但該蛋白在細(xì)胞和病毒粒子中含量很少。

預(yù)測的5a蛋白為Ⅰ型跨膜蛋白，在Ⅱ型PRRSV 5a蛋白的膜內(nèi)區(qū)有2個(gè)相鄰的半胱氨酸（29和30位），它們可能形成二硫鍵與5a蛋白單體或其它蛋白形成多聚體。5a蛋白C端有一個(gè)在動(dòng)脈炎病毒中保守的RQ基元，認(rèn)為能與RNA結(jié)合調(diào)節(jié)mRNA的剪接與轉(zhuǎn)運(yùn)。Firth A E等［10］通過突變EAV ORF5a起始密碼子從而阻止5a蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)突變病毒比親本毒的生長滴度降低了2個(gè)log，且空斑形態(tài)減小，因此認(rèn)為5a蛋白與動(dòng)脈炎病毒RNA加工、轉(zhuǎn)運(yùn)和包裝的高效性有關(guān)。Han W等［11］將JXA－1傳至第80代，在 ORF5a內(nèi)部 ORF5之前有4個(gè)氨基酸的插入，表明5a蛋白胞外區(qū)的長度改變不影響5a蛋白的功能。研究證明，在Ⅱ型PRRSV感染的細(xì)胞及豬體內(nèi)，均能檢測到5a蛋白及針對5a蛋白的抗體，但是產(chǎn)生的抗體較少，因此5a蛋白可能主要介導(dǎo)的是細(xì)胞免疫［12］。

5a蛋白的發(fā)現(xiàn)為動(dòng)脈炎病毒的免疫學(xué)及藥理學(xué)研究提供了潛在的靶點(diǎn)，而對其結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識需要更加深入的研究。

2.2 主要囊膜蛋白

2.2.1 GP5 GP5是病毒粒子中最豐富的糖蛋白，含有200（Ⅱ型）或201（Ⅰ型）個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為25ku。經(jīng)預(yù)測，N端是一段31個(gè)氨基酸的信號肽，形成三次跨膜結(jié)構(gòu)，膜外區(qū)由30個(gè)氨基酸組成，C端的50～72個(gè)氨基酸為膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域。對不同毒株P(guān)RRSV GP5蛋白的氨基酸和核苷酸序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)GP5有1個(gè)高變區(qū)（32aa～40aa）、2個(gè)多變區(qū)（57aa～70aa和121aa～130aa）、3個(gè)保守區(qū)（41aa～56aa，71aa～120aa，131aa～200aa）和2～4個(gè)糖基化位點(diǎn)。

GP5的糖基化位點(diǎn)及程度在病毒復(fù)制過程中的作用尚不清楚。Osorio實(shí)驗(yàn)室對經(jīng)典北美型PRRSV GP5的3個(gè) N－糖基化位點(diǎn) （N34、N44、N51）進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn) N33、N55、N33／N55的糖基化降低了病毒的生長滴度，對抗體的敏感性也增強(qiáng)，但該脫糖化病毒卻可以激發(fā)比野毒株產(chǎn)生更高水平的中和抗體，表明GP5膜外區(qū)的多糖的缺失能夠提高病毒對抗體的中和能力和其附近中和表位B的免疫原性。同時(shí)，該研究中N44糖基化位點(diǎn)的脫糖基化卻導(dǎo)致全長cDNA不能拯救出病毒，說明N44位點(diǎn)對該株病毒的復(fù)制過程起關(guān)鍵作用。但是，自然毒株中，也存在著較多的N44位糖基化位點(diǎn)缺失的突變毒株，說明了該研究中的N44位點(diǎn)氨基酸的改變（或者可能改變了GP5a的蛋白序列）導(dǎo)致了突變克隆未能拯救出病毒。對歐洲型PRRSV的N46糖基化位點(diǎn)（相對應(yīng)于Ⅱ型PRRSV N44）進(jìn)行突變能夠拯救出病毒也間接的說明了這一點(diǎn)，但該糖基化位點(diǎn)突變對病毒顆粒的產(chǎn)生和病毒粒子的感染性都有較大影響［3］。其原因可能是失去了寡糖的GP5蛋白不能正確折疊，病毒與受體的相互作用減弱，降低了病毒的特異的感染性。通過對PRRSV自然分離株N44株（GP5N44糖基化位點(diǎn)自然缺失）研究也發(fā)現(xiàn)，與VR2332相比，該毒株的N44位點(diǎn)缺失未能提高病毒對抗體的易感性，且GP5中和表位B的免疫原性卻顯著降低，免疫豬后41d才能產(chǎn)生中和抗體［13］。但該研究沒能闡明中和表位免疫原性降低是由于N44位點(diǎn)糖基化位點(diǎn)缺失還是中和表位附近的氨基酸不同（與VR2332相比），且與通過重組腺病毒表達(dá)突變N44糖基化位點(diǎn)的GP5免疫鼠的研究結(jié)果相矛盾［14］。

GP5蛋白是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，表面存在對于抗感染很重要的中和表位。用豬多克隆抗血清和單克隆抗體鑒定了GP5有1個(gè)非中和表位A（27aa～30aa）和1個(gè)中和表位B（37aa～45aa）。表位B在PRRSV分離株中高度保守，但不是免疫優(yōu)勢表位，在PRRSV感染后期才出現(xiàn)抗表位B的中和抗體。而表位A具有高變異性，具有免疫優(yōu)勢，在PRRSV感染早期即可出現(xiàn)抗該表位的抗體。因此認(rèn)為非中和表位A作為一個(gè)誘騙表位延遲了中和抗體產(chǎn)生的時(shí)間。存在于表位B周圍的N－多糖能夠降低GP5中和決定簇的免疫原性，可見誘騙表位和具有糖基遮蔽作用的糖基化位點(diǎn)的存在影響了免疫系統(tǒng)對中和表位的識別。

此外，GP5蛋白在體內(nèi)外均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其N端的118個(gè)氨基酸對于保持GP5誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性必不可少［15］。

2.2.2 M蛋白 基質(zhì)蛋白（M）是由ORF6編碼的非糖基化膜蛋白，分子質(zhì)量約18ku～19ku，北美株和歐洲株分別含有174和173個(gè)氨基酸。M蛋白在所有的PRRSV株間都是最為保守的結(jié)構(gòu)蛋白，其N端有3個(gè)明顯的疏水區(qū)（17aa～88aa），形成3次跨膜。M蛋白聚集在其感染細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過二硫鍵與GP5形成異源二聚體，參與病毒粒子的形成。

M蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，感染后10d即可以檢測該抗體應(yīng)答，因此檢測M蛋白的抗體可以作為PRRSV感染的診斷與監(jiān)測指征。表達(dá)的重組M蛋白可以作為血清學(xué)試驗(yàn)的靶抗原，Jiang W等［14］構(gòu)建的同時(shí)表達(dá)GP5和M蛋白的腺病毒重組病毒（Ad－GP5－M）在小鼠體內(nèi)有很好的免疫效果，并且研究表明M蛋白可以通過增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)和提高中和抗體產(chǎn)生來增強(qiáng)抗GP5的免疫反應(yīng)。

2.3 PRRSV細(xì)胞受體結(jié)合蛋白與細(xì)胞表面受體

PRRSV具有嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性（cellular tropism）。在體內(nèi)，PRRSV僅能感染單核／巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞；在體外，PRRSV只能感染非洲綠猴腎細(xì)胞系MA104及其衍生細(xì)胞系 Marc－145；但將PRRSV的基因組RNA轉(zhuǎn)染非容許性 （non－permissive）細(xì)胞，如BHK－21和Vero細(xì)胞，病毒能夠在非容許性細(xì)胞系中進(jìn)行生產(chǎn)性感染（productive infection）；通過 聚 乙 二 醇 （polyethylene glycol，PEG）介 導(dǎo)PRRSV粒子進(jìn)入非容許性細(xì)胞后，病毒可以在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并產(chǎn)生感染性病毒粒子。以上研究說明了病毒的囊膜蛋白在介導(dǎo)病毒與細(xì)胞受體結(jié)合進(jìn)而入侵細(xì)胞的過程起到重要的作用［16］。

迄今為止，PRRSV入侵的細(xì)胞受體及與其結(jié)合的病毒囊膜蛋白尚存在爭議。初步研究發(fā)現(xiàn)，存在于豬肺泡巨噬細(xì)胞（pig alveolar macrophage，PAM）表面上有3種可能的細(xì)胞受體，包括硫酸乙酰肝素（heparan sulphate，Hs）、唾液酸黏附素（sialodhesin，Sn）和CD163。究竟哪種分子是介導(dǎo)病毒吸附（adsorption）的細(xì)胞受體（receptor）？這個(gè)問題在歐洲和美國學(xué)者之間爭議頗大。美方證據(jù)表明CD163為PRRSV的細(xì)胞受體，主要依據(jù)是，Marc－145表面不表達(dá)Sn，但其卻是惟一的體外傳代細(xì)胞系；PAM和 Marc－145細(xì)胞表面均表達(dá)受體CD163；CD163能夠賦予非容許性細(xì)胞復(fù)制PRRSV的能力，將表達(dá)的CD163的載體轉(zhuǎn)染到非容許性細(xì)胞系BHK－21、Vero和PK－15等細(xì)胞，病毒通過與CD163的作用來侵入這些細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，這個(gè)過程不需要Hs和Sn等分子的存在。而歐方則認(rèn)為Hs、Sn和CD163分子分別在介導(dǎo)病毒結(jié)合（binding）、內(nèi)化（internalization）和 脫 殼 （uncoating）釋 放 基 因 組RNA到胞漿中進(jìn)行復(fù)制的過程中起重要作用。在這個(gè)過程中，PAM表面的Hs與病毒的M蛋白結(jié)合，使病毒粒子在細(xì)胞表面聚集，接著Sn通過與病毒的GP5／M復(fù)合物相互作用來介導(dǎo)病毒內(nèi)化（internalization）進(jìn)入披網(wǎng)格蛋白囊泡（clathrin－coated vesicles），在CD163的作用下，在酸化了的囊泡中釋放病毒的RNA，從而完成病毒入侵。換言之，CD163并非病毒受體，而是作為一個(gè)輔助病毒顆粒脫殼釋放基因組的因子［17－18］。另一方面，在充分有力的試驗(yàn)證據(jù)證明CD163是PRRSV受體的前提下，Das等證實(shí)了與CD163結(jié)合的病毒囊膜蛋白為GP2a和GP4形成的復(fù)合體，GP2a和GP4表面的糖原可有效的促進(jìn)病毒蛋白和受體的結(jié)合［19－20］。需要指出的是，由于兩個(gè)研究小組所認(rèn)定的細(xì)胞受體不一樣，所鑒定的相對應(yīng)的病毒的細(xì)胞受體結(jié)合蛋白也不一致。換言之，究竟何種結(jié)構(gòu)蛋白或復(fù)合體行使PRRSV細(xì)胞結(jié)合蛋白（viral attachment protein）目前尚無定論。在這些研究之前，Dobbe等在EAV感染性克隆的基礎(chǔ)上，將GP5和M蛋白的膜外區(qū)替換為PRRSV的相對應(yīng)蛋白的膜外區(qū)，發(fā)現(xiàn)GP5和M蛋白的膜外區(qū)并不影響病毒的細(xì)胞嗜性，暗示著GP5和M蛋白不是細(xì)胞受體結(jié)合蛋白。

2.4 N蛋白

核衣殼蛋白（N蛋白）是由ORF7編碼的一種堿性磷酸蛋白，分子質(zhì)量為15ku，是病毒粒子中含量最豐富的蛋白，大約占病毒粒子的40%。N蛋白在歐美兩型毒株間相對比較保守，分別包括128和123個(gè)氨基酸。N蛋白是病毒最主要的抗原組分，具有極強(qiáng)的免疫原性，機(jī)體最早產(chǎn)生的是N蛋白的抗體，但為非中和抗體，對機(jī)體無保護(hù)作用。

成熟的病毒粒子中N蛋白以二聚體的形式存在，研究表明23位的Cys介導(dǎo)形成的N－N同源二聚體對于病毒的感染性是必需的。N蛋白的N端存在一個(gè)RNA結(jié)合域，此區(qū)域富含堿性氨基酸且高度靈活，有助于其和基因組RNA的相互作用，N蛋白最重要的功能即是與基因組RNA結(jié)合完成病毒粒子的裝配過程。此外，該區(qū)域參與蛋白與核酸或其他蛋白的結(jié)合，起著分子識別、分子組裝和蛋白修飾等功能［21］。

PRRSV復(fù)制過程發(fā)生于感染細(xì)胞的細(xì)胞漿，但N蛋白卻可以同時(shí)定位于細(xì)胞漿與細(xì)胞核［22］。PRRSV N蛋白含有兩段保守的堿性氨基酸，即10～13位和41～47位，分別符合典型核定位信號（nuclear localization signal，NLS）的“pat4”和“pat7”基序，稱為NLS－1和NLS－2。N端1～14位氨基酸的刪除并不影響N蛋白的核定位，因此NLS－1可能是一個(gè)隱含的核定位信號［23］。通過對NLS－2的氨基酸替換，確定了KKNKK是NLS－2的核心序列，且43和44位的賴氨酸足以使N蛋白定位到細(xì)胞核中［24］。為了研究N蛋白核定位的生物學(xué)功能，Lee C等［22］將NLS序列中43和44位的兩個(gè)關(guān)鍵的賴氨酸突變成甘氨酸，證明NLS突變不影響子代病毒的產(chǎn)生，但突變病毒滴度降低。用NLS突變病毒接種豬能產(chǎn)生較高的中和抗體，但檢測到的NLS序列都發(fā)生了回復(fù)突變，回復(fù)突變使N蛋白重新定位到細(xì)胞核，說明N蛋白的NLS位點(diǎn)在體內(nèi)有很強(qiáng)的選擇壓力。Pei Y等［25］通過刪除或替換構(gòu)建了9個(gè)NLS突變體，大部分突變體影響了N蛋白在細(xì)胞核的定位，且突變病毒體外接種豬都產(chǎn)生了高于野生型滴度的中和抗體，表明N蛋白的細(xì)胞核定位可能與PRRSV在體內(nèi)的致病性及宿主應(yīng)答有關(guān)。Tan F等［26］通過構(gòu)建一系列的缺失及突變感染性克隆，證明Ⅱ型PRRRSV N蛋白N端5～13、39～42、48～52位氨基酸及C端最后4個(gè)氨基酸都是非必需的，這些氨基酸的缺失并不影響病毒粒子的感染性。有趣的是，其中5～13、39～42正好分別位于NLS－1和NLS－2功能域。關(guān)于N蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的功能，目前還沒有明確的答案，但在冠狀病毒中已經(jīng)證明N蛋白進(jìn)入細(xì)胞核中可以通過抑制細(xì)胞分裂而調(diào)控宿主細(xì)胞的復(fù)制。在PRRSV中，Yoo D等［24］證明N蛋白能夠與28S和18S核糖體RNA相互作用，且能夠與細(xì)胞核中的核仁纖維蛋白相互作用。總之，N蛋白可能通過調(diào)控宿主細(xì)胞的功能來調(diào)節(jié)自身的復(fù)制，但是具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)語

隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)的飛速發(fā)展，對PRRSV的基因組結(jié)構(gòu)及其編碼的蛋白有了更加全面的認(rèn)識。反向遺傳操作技術(shù)（reverse genetic manipulation，RGS）的發(fā)展，為研究病毒單個(gè)基因在病毒復(fù)制過程中的作用提供了平臺。RGS技術(shù)已用于PRRSV結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)蛋白特性的研究，利用RGS來研究結(jié)構(gòu)蛋白的特性及開發(fā)新型疫苗將成為未來的研究方向。

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