王 梅，徐乃豐，劉麗強(qiáng)，匡 華，林 菲，宋珊珊，王澤路，胥傳來,*

(1.蘇州大學(xué)分析測試中心，江蘇 蘇州 215123；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

孔雀石綠抗原的合成及多克隆抗體的制備

王 梅1，徐乃豐2，劉麗強(qiáng)2，匡 華2，林 菲2，宋珊珊2，王澤路2，胥傳來2,*

(1.蘇州大學(xué)分析測試中心，江蘇 蘇州 215123；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

通過研究孔雀石綠(MG)抗原的合成和多克隆抗體的制備，探索研究食品中孔雀石綠殘留的檢測方法。本實(shí)驗(yàn)先合成含有羧基的孔雀石綠半抗原(CMG)，并用液-質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行分析鑒定。半抗原經(jīng)重氮化法處理后分別偶聯(lián)兩種載體蛋白BSA和OVA，并通過紫外分光光度法進(jìn)行鑒定。與CMG標(biāo)準(zhǔn)品和兩種載體蛋白的紫外吸收光譜相比，偶聯(lián)物的吸收峰發(fā)生了明顯的偏移，計(jì)算得免疫原的偶聯(lián)比為10.6:1，說明偶聯(lián)成功。通過免疫制備多克隆抗體，并通過間接ELISA法對CMG抗血清的效價進(jìn)行檢測，并進(jìn)一步檢測抗體的特異性，兩只兔子的IC50值分別為8.1ng/mL和4.6ng/mL。

孔雀石綠；抗原；多克隆抗體；間接ELISA法

孔雀石綠(CMG)(結(jié)構(gòu)式見圖1)是一種工業(yè)染料，具有抗菌殺蟲作用，被廣泛應(yīng)用于真絲、羊毛、皮革、麻制品、陶瓷制品和棉布等的染色中；還可用作生物染色劑，將細(xì)胞或組織染成藍(lán)綠色，以便于在顯微鏡下觀察[1-5]。利用血液中的血色素催化隱性孔雀石綠與過氧化氫反應(yīng)，使無色的隱性孔雀石綠轉(zhuǎn)變?yōu)榭兹甘G的現(xiàn)象，在刑偵中可用于檢測不易察覺的血跡。另外，孔雀石綠能抑制細(xì)胞分裂，從而產(chǎn)生良好的抗菌和殺菌作用。由于價格低廉，孔雀石綠曾被廣泛地用于預(yù)防和治療水產(chǎn)品的水霉病、鰓霉病和寄生蟲病等；也曾被用于水產(chǎn)品的運(yùn)輸和存放過程[6-11]。但是孔雀石綠具有高毒性、高殘留和致癌、致畸和致突變作用，嚴(yán)重威脅人類健康，因此檢測孔雀石綠殘留具有十分重要的意義[12-16]。

圖1 孔雀石綠和隱性孔雀石綠結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structures of malachite green (MG) and leucomalachite green

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

孔雀石綠、對羧基苯甲醛、N,N-二甲基苯胺(DMA)、2-嗎啉乙磺酸(2-morpholino-ethanesulfonic acid，MES)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、碳二亞胺(EDC)、離子交換樹脂 上海晶純試劑有限公司；無水氯化鋅、無水乙醇、二甲基亞砜(DMSO) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 華美生物工程公司；Milli-Q超純水 美國Millipore公司；牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA) 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-40B臺式低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；石英自動雙重純水蒸餾器 金壇市榮華儀器制造有限公司；ZD-9556水平搖床 太倉科教器材廠；Costar 96孔可拆酶標(biāo)板 上海吉泰生物科技有限公司；Multiska Mks酶標(biāo)儀、可調(diào)試移液器 英國Thermo Labsystems公司；Agilent 6890N氣相色譜-Agilent 5973N型質(zhì)譜檢測器 美國Finigon質(zhì)譜公司；Alliance型高效液相色譜系統(tǒng)、Symmetry C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm) 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 孔雀石綠人工抗原的制備

1.3.1.1 孔雀石綠半抗原的合成

將12mmol對羧基苯甲醛、38mmol蒸餾得到的N,N-二甲基苯胺和36mmol無水氯化鋅溶解在60mL無水乙醇中，在N2保護(hù)下，95℃加熱回流24h。室溫冷卻后，加入 30mL甲醇，并滴加1mol/L HCl調(diào)節(jié) pH 值至 3.0～5.0，得到微綠色的晶體。過濾溶液，并沖洗晶體，真空干燥得到約3.6g羧基化的隱性孔雀石綠。

將1.2g CMG和1.2g氧化鉛加入到24mL的1mol/L HCl溶液中，45℃加熱回流24h。反應(yīng)液室溫冷卻后，加入30mL甲醇，過濾并將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到約1.9g羧基化的孔雀石綠衍生物。

1.3.1.2 孔雀石綠人工免疫原的合成

取30mg CMG溶解于4mL 0.1mol/L、pH6.0 MES溶液(含50% DMSO)中，離心去除溶液中不溶物。加入18.75mg NHS攪拌溶解，反應(yīng)10min后加入30mg EDC，繼續(xù)攪拌反應(yīng)4h，得到A液；取50mg cBSA溶解于2mL 0.05mol/L、pH8.0的硼酸鹽緩沖液中，為B液。將A液緩慢逐滴加入B液中，磁力攪拌24h，保持溶液體系pH8.0。反應(yīng)完全后用0.01mol/L PBS溶液透析48h，每8h換水，透析完畢，置于4℃冰箱中保存待用。

1.3.2 多克隆抗體的制備

1.3.2.1 免疫程序

選兩只健康新西蘭大白兔，分籠飼養(yǎng)，標(biāo)號1、2分組。將抗原用生理鹽水溶解稀釋，第一次用弗氏完全佐劑乳化，使抗原質(zhì)量濃度為1mg/mL，初次免疫頸背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射。初免后的免疫稱為加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑乳化，進(jìn)行肌肉注射。注射頻率，初免至二免間隔30d，以后15d注射一次，注射量與初免相同，共注射5次。注射方法：首次為皮內(nèi)注射，用手術(shù)剪把兔子脊椎兩側(cè)的毛剪掉，露出皮膚，用注射器進(jìn)行皮下注射，使用弗氏完全佐劑。中間的免疫為肌肉注射，注射部位在兔子大腿和臀部位置的肌肉，注意不要傷到兔子的神經(jīng)線。使用弗氏不完全佐劑。三次免疫后從耳緣靜脈采血，采入離心管中，5000r/min離心8min。吸取上層血清放入另一個離心管中，標(biāo)號冷藏保存待檢。具體免疫程序見表1。

表1 兔子免疫程序Table 1 Immunization procedure for rabbits

1.3.2.2 效價、包被抗原和抗體的最適工作濃度測定

采用間接ELISA方法測定效價、包被抗原和抗體的最適工作濃度。將包被緩沖液系列稀釋250、500、1000、2000、4000、8000倍后包被96孔酶標(biāo)板，100μL/孔，于4℃冰箱過夜。取回至室溫，以0.01mol/L PBST溶液作為洗滌液，洗滌3min后拍干，重復(fù)3次。以下洗滌方法相同。充分洗滌后，用封閉液封閉，200μL/孔，置于4℃冰箱過夜。洗滌后，置于37℃烘箱內(nèi)15min烘干，置于4℃冰箱備用。

將采集的免疫血清系列梯度稀釋250、500、1000、2000、4000、8000、16000、32000倍，對應(yīng)加入到酶標(biāo)板的每行，100μL/孔，室溫孵育30min后洗滌、拍干；加入酶標(biāo)二抗，100μL/孔，室溫孵育30min后洗滌、拍干；加入顯色液(TMB與底物液比例為1:10)，100μL/孔，暗處反應(yīng)15min后，取出加入終止液(2mol/L H2SO4)，100μL/孔，用酶標(biāo)儀測定450nm波長處的光密度值。

選擇陽性血清的OD值大于1.0，同時與陰性血清的OD值差距最大的包被原稀釋濃度、抗體稀釋濃度為最佳工作濃度。陽性血清的OD值不小于陰性對照孔的2.1倍并且OD值大于0.1，此時血清的稀釋倍數(shù)即為血清的效價。

1.3.2.3 免疫血清特異性的檢測

要獲得高靈敏度、高特異性的抗血清，不僅要求合適的工作濃度、高效價，同時要考察其特異性的強(qiáng)弱，繪制抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定其半數(shù)抑制率IC50值。

以所得最佳包被濃度對包被原進(jìn)行系列梯度稀釋并包被，設(shè)置兩個對照，置于4℃冰箱保存過夜。取出洗滌后以封閉液封閉，200μL/孔，置于4℃冰箱保存過夜。取出洗滌，拍干。第一排加抗體稀釋液，第二排起分別加7個濃度的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液，50μL/孔。以最佳稀釋濃度稀釋抗體并添加，50μL/孔，充分振蕩混勻，37℃孵育30min。取出洗滌5次，拍干。加入3000倍稀釋的酶標(biāo)二抗，100μL/孔，37℃烘箱中反應(yīng)30min。洗滌3次，拍干，加入顯色液，100μL/孔，37℃暗處反應(yīng)15min。加終止液(2mol/L濃硫酸)，100μL/孔，酶標(biāo)儀上檢測OD值，各濃度的B/B0。

式中：B0為孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品溶液添加0ng/mL時的OD值，即陰性對照孔的校正值。

以B/B0為縱坐標(biāo)，以孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品溶液添加的系列梯度濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)作圖，即得孔雀石綠的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。IC50表示達(dá)到最大OD值一半時所添加的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

1.3.3 偶聯(lián)比的測定

式中：εCMG-BSA、εBSA、εCMG分別為CMG-BSA、BSA、CMG對應(yīng)的摩爾消光系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 孔雀石綠衍生結(jié)果

圖2 孔雀石綠半抗原的液相圖譜Fig.2 Liquid chromatogram of malachite green hapten

反應(yīng)后相對分子質(zhì)量為374，通過LC-MS檢測分析得出，出峰時間在4.118min(圖2)，對應(yīng)的質(zhì)譜如圖3所示，質(zhì)譜圖中有374、373、371的片段峰，初步說明衍生成功，即可初步確定得到了所需要的人工半抗原。

圖3 孔雀石綠人工半抗原的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of malachite green hapten

2.2 偶聯(lián)物的紫外光譜分析

2.2.1 孔雀石綠人工免疫原的鑒定

配制相同濃度的人工半抗原、免疫原和cBSA，用紫外分光光度計(jì)檢測，結(jié)果見圖4。

圖4 CMG-cBSA偶聯(lián)的紫外圖譜Fig.4 UV-visible spectrum of CMG-cBSA conjugate

由圖4可知，半抗原在255、317、425、618nm波長處有特征吸收峰，BSA在波長280nm左右處具有特征吸收峰，而合成的人工免疫原不僅在波長240nm和320nm左右具有與代謝物半抗原相似的特征吸收峰，而且在與相同濃度的BSA溶液進(jìn)行比較時，可以明顯看出，它的吸光度要比相同濃度BSA的吸光度普遍偏高，尤其在300nm波長以后，BSA的吸光度趨向于0，而偶聯(lián)物仍然具有吸光度，且在320nm特征吸光度處出現(xiàn)與代謝物半抗原相似的吸收峰，根據(jù)疊加原理可知，代謝物半抗原與BSA成功偶聯(lián)。

2.2.2 孔雀石綠人工包被原的鑒定

配制一定濃度的人工半抗原、包被原和OVA，其中免疫原與OVA濃度相同，用紫外分光光度計(jì)掃描波長在200～800nm之間，結(jié)果見圖5。

從圖5可以看出，半抗原在255、317、425、618nm波長處有特征吸收峰，OVA在波長280nm左右處具有特征吸收峰，而合成的人工免疫原不僅在波長240nm和320nm左右具有與代謝物半抗原相似的特征吸收峰，而且在與相同濃度的BSA溶液進(jìn)行比較時，可以明顯看出，它的吸光度要比相同濃度BSA的吸光度普遍偏高，尤其在300nm以后，BSA的吸光度趨向于0，而偶聯(lián)物仍然具有光吸收，且在320nm特征吸光度處出現(xiàn)與代謝物半抗原相似的吸收峰，根據(jù)疊加原理可知，代謝物半抗原與OVA成功偶聯(lián)。

表2 免疫血清的效價Table 2 Titer of antiserum

圖5 CMG-OVA偶聯(lián)的紫外圖譜Fig.5 UV-visible spectrum of CMG-OVA conjugate

2.2.3 偶聯(lián)比的確定

通過1.3.3節(jié)公式計(jì)算出CMG-BSA即人工免疫原的偶聯(lián)比是10.6:1，證明偶聯(lián)有效。同理計(jì)算出CMG-OVA的偶聯(lián)比是20.5:1，與空間位點(diǎn)的結(jié)合效率比較高，說明包被原偶聯(lián)成功。

2.2.4 最佳工作點(diǎn)和效價的測定

陰性血清光密度值為0.090，從表2可以看出，1號和2號兔子的效價分別為8000和4000，相對應(yīng)的最佳工作濃度(抗原稀釋倍數(shù)/抗體稀釋倍數(shù)) 為250/8000和250/8000。

2.2.5 抗體特異性的測定

經(jīng)抗體特異性檢測，兩只兔子抗孔雀石綠抗體的IC50分別為8.1ng/mL和4.6ng/mL，從而2號兔子較1號兔子好。

3 結(jié) 論

在本研究中，通過化學(xué)合成的方法成功的合成出兩種不同載體的孔雀石綠人工抗原并通過兩種不同手段分別對其結(jié)構(gòu)和免疫效果進(jìn)行了驗(yàn)證。

儀器分析手段：用化學(xué)方法合成羧基化的孔雀石綠半抗原并用液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行分離、檢測，證明有目標(biāo)相對分子質(zhì)量的產(chǎn)物出現(xiàn)且有一定含量。對于蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物，利用紫外光譜對其進(jìn)行掃描，通過產(chǎn)物和CMG以及兩種蛋白標(biāo)準(zhǔn)品圖譜的對比，發(fā)現(xiàn)明顯的紫外吸收峰偏移，證明在結(jié)構(gòu)上已經(jīng)完成偶聯(lián)。

免疫檢測手段：對已合成好的偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行方法學(xué)實(shí)驗(yàn)，對新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，提取血清后進(jìn)行ELISA檢測，通過和陰性血清的對比，其光密度值遠(yuǎn)高于陰性血清的光密度值，區(qū)別較明顯，由此可以證明該抗原能夠成功刺激動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體。

[1] 胥傳來, 王利兵. 食品免疫化學(xué)與分析[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2009.

[2] 邱緒建, 林洪, 江潔. 漁藥孔雀石綠及其關(guān)聯(lián)化合物檢測方法研究進(jìn)展[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2005, 26(2): 92-961.

[3] 孫滿義, 楊賢慶, 岑劍偉, 等. 水產(chǎn)品中孔雀石綠的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2009(2): 312-315.

[4] 何麗華, 沈國順, 鄒偉. 孔雀石綠及其危害[J]. 特養(yǎng)與水產(chǎn), 2006, 27 (5): 45-46; 48.

[5] 王權(quán), 郭德華, 李健, 等. 孔雀石綠間接競爭ELISA檢測方法的建立[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2010, 42(2): 6-9.

[6] 張賓, 王予輝. 常用動物實(shí)驗(yàn)操作指南[M]. 上海: 上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社, 2007.

[7] 邢瑋瑋, 王榕妹, 王俊卿, 等. 酶聯(lián)免疫吸附分析法測定水產(chǎn)品及水中孔雀石綠和無色孔雀石綠[J]. 化學(xué)與研究, 2010, 22(1): 42-46.

[8] 沈玉棟, 王宇, 孫遠(yuǎn)明, 等. 隱孔雀石綠半抗原與全抗原設(shè)計(jì)、合成及鑒定[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(7): 263-266.

[9] 于慧梅. 食品中硝基呋喃代謝物和孔雀石綠的分析方法研究[D]. 北京: 北京化工大學(xué), 2008.

[10] 劉愛紅, 張琳. 農(nóng)藥殘留與食品安全[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(13): 4017-4018

[11] 胡昌勤, 劉煒. 抗生素微生物檢定法及其標(biāo)準(zhǔn)操作[M]. 北京: 氣象出版社, 2004.

[12] MASCHER D G, UNGER C P, MASCHER H J. Determination of neomycin and bacitracin in human or rabbit serum by HPLC-MS/MS [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2007, 43(2): 691-700.

[13] FOSTER F J, WOODBUR Y L. The use of malachite green as a fish fungicide and antisptic[J]. Prog Fish Cult, 1936, 18(3): 7-9.

[14] HERNANDO M D, MEZCUA M, SUAREZ-BAREENA J M A, et al. Liquid chromatography with time of flight mass spectrometry simultaneous determination chemotherapeutant residues in salmon[J]. Analytica Chimica Acta, 2006, 562(2): 176-184.

[15] BERGWERFF A A, SCHERPENISSE P. Determination of residues of malachite green in aquatic animals[J]. Journal of Chromatogy B: Analysis Technology Biomed Life Science, 2003, 788(2): 351-359.

[16] LEE K C, WU J L, CAI Z W. Determination of malachite green and leucomalachite green in edible goldfish muscle by liquid chromatography-ion trap mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2006, 843(2): 247-251.

Synthesis of Artificial Antigen and Preparation of Polyclonal Antibody for Malachite Green

WANG Mei1，XU Nai-feng2，LIU Li-qiang2，KUANG Hua2，LIN Fei2，SONG Shan-shan2，WANG Ze-lu2，XU Chuan-lai2,*
(1. Analytical and Testing Center, Suzhou University, Suzhou 215123, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to determine malachite green (MG) residues in food, the synthesis of antigen and preparation of polyclonal antibody for MG were explored. In this study, carboxylic malachite green (CMG) hapten was first synthesized and analyzed by LC-MS. The hapten was coupled separately with the two carrier proteins BSA and OVA by diazotization method, and identified by UV-visible spectroscopy method. Compared with CMG standard, BSA and OVA, the absorption peaks CMG-BSA and CMG-OVA displayed a marked shift, indicating that the successful conjugation between CMG and BSA or OVA, and the coupling ratio of the immunogen CMG-BSA was calculated to be 10.6:1. Polyclonal antibody for MG was prepared by immunization with CMG-BSA and evaluated using the titer of anti-CMG antisera determined by indirect ELISA. Furthermore, two rabbits were used to evaluate antibody specificity with determined IC50values of 8.1 ng/mL and 4.6 ng/mL, respectively.

malachite green (MG)；antigen；polyclonal antibody；indirect ELISA

R392.11

A

1002-6630(2011)07-0282-04

2010-07-16

王梅(1981—)，女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)闅埩粑餀z測。E-mail：wangmei1222@suda.edu.cn

*通信作者：胥傳來(1965—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：xcl@jiangnan.edu.cn