鄧海臨,李大鵬

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002;2.中國科學(xué)院 海洋研究所,山東 青島 266071)

Sutherland在研究腎上腺素引起肝細(xì)胞中糖原分解成葡萄糖時(shí)發(fā)現(xiàn),如果使腎上腺素和分離出來的細(xì)胞膜碎片互相作用,可生成一種當(dāng)時(shí)不知名的小分子物質(zhì),當(dāng)把這種物質(zhì)單獨(dú)和肝細(xì)胞的胞漿接觸時(shí),也能引起胞漿中糖元的分解,其作用和腎上腺素作用于完整的肝細(xì)胞時(shí)類似。這說明腎上腺素并不是直接作用于糖元,而是作用于細(xì)胞膜上,促使其生成小分子物質(zhì)的結(jié)果。這種小分子物質(zhì)就是后來證明的cAMP(環(huán)腺苷酸)。cAMP的發(fā)現(xiàn)徹底改變了人們對(duì)新陳代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識(shí),人們把蛋白激酶和磷酸化作用以及去磷酸化作用調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的系統(tǒng)歸為生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的第二信使系統(tǒng)之一。cAMP作為第二信使普遍存在于細(xì)菌、真核微生物、真菌以及多細(xì)胞動(dòng)物,此外,對(duì)外界信號(hào)作出的一系列細(xì)胞反應(yīng)都與cAMP有關(guān)。由于植物中cAMP含量通常較低,一般的檢測(cè)方法難以達(dá)到要求,隨著酶聯(lián)免疫法、液相色譜法、質(zhì)譜法等新型精確檢測(cè)方法的應(yīng)用,使得植物細(xì)胞中含有 cAMP得到肯定,也使海藻中cAMP的研究得到了較快的發(fā)展。

1 cAMP信號(hào)系統(tǒng)的組成

1.1 腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase,AC)

AC是合成cAMP的關(guān)鍵酶類,目前已知有9種腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase,AC)異構(gòu)體。根據(jù)AC氨基酸序列,至少可分為兩種亞類。各種AC異構(gòu)體表達(dá)的組織特異性會(huì)影響不同組織在特異刺激下合成cAMP的量。除了由G蛋白激活,AC也能整合G蛋白的βγ亞基、蛋白激酶 C以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子等轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)。

目前,通常使用組織化學(xué)和生物化學(xué)方法檢測(cè)植物組織中的 AC活性。組織化學(xué)法主要基于標(biāo)準(zhǔn)Wachstein-Meisel法磷酸鉛沉淀技術(shù)[1],以ATP作為AC的底物,用電子顯微鏡檢測(cè)ATP形成cAMP過程中產(chǎn)生的 PPi與鈰形成電子致密沉淀物的量來代表AC的活性。因?yàn)榧?xì)胞含有大量ATP水解酶不斷地釋放 Pi,在這一過程中產(chǎn)生許多假陽性反應(yīng),很多化合物都不能避免干擾活動(dòng)。后來采用對(duì)ATP酶敏感較低的 5'-三磷酸亞酰胺腺苷代替 ATP作為底物[2],運(yùn)用這種方法,最早在細(xì)胞質(zhì)膜中發(fā)現(xiàn)AC的活性。此外,在玉米根尖內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜、核膜[3]以及豌豆內(nèi)膜[4]上都檢測(cè)到AC活性。植物學(xué)家發(fā)現(xiàn)AC的許多生理作用。Rougier[5]提出AC活性是楊樹花粉管穩(wěn)定形成的重要因素,Curvetto[6]在蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞中定位了AC活性是由IAA、Ca2+、咖啡因、GTP等激活的。作者認(rèn)為在一定程度上 cAMP參與了氣孔運(yùn)動(dòng)中由G蛋白引起的 IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體系。此外,在菜豆初生葉的細(xì)胞質(zhì)膜外和類囊體膜中也發(fā)現(xiàn)了 AC的活性,另一項(xiàng)研究通過免疫定位在葉綠體和細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)了cAMP[7]。

組織化學(xué)方法難以精確定位AC活性,只能揭示其在生理過程中有一定的作用。生物化學(xué)方法實(shí)際上是用放射性同位素標(biāo)記cAMP的前體(ATP或者5'-三磷酸亞酰胺腺苷)測(cè)定合成放射性具有cAMP的含量來檢測(cè)AC的活性。不過早期的研究因無法檢測(cè)新合成的化合物而遭到質(zhì)疑,隨著更加精確的分離技術(shù)的發(fā)展,生物化學(xué)方法提供更加可靠的證據(jù)。例如,Carricarte[8]初步估計(jì)了苜蓿(Medicago sativaL.)中水溶性AC的分子質(zhì)量為84 ku,并發(fā)現(xiàn)AC的活性依賴于 Ca/CaM 與 G蛋白的功能無關(guān)。相比之下,Lusini[9]在蓖麻根中檢測(cè)到 AC的活性。酶活性大約在20 pmol/(min·mg),而AC的活性與G蛋白和NaF有關(guān),AC可能受 G蛋白調(diào)控。運(yùn)用質(zhì)譜分析技術(shù)Pacini[10]在豌豆中檢測(cè)到AC活性。AC用Mg2+-ATP作為底物合成cAMP,AC的活性與GTP存在很大關(guān)聯(lián)。低濃度的GTP激活A(yù)C活性,而過高濃度的GTP抑制其活性,這可能是因?yàn)榕c ATP競(jìng)爭(zhēng)造成的。Cooke[11]在研究紫花苜蓿細(xì)胞組織時(shí)發(fā)現(xiàn),植物黃萎病致病菌激發(fā)AC的活性。AC的活性依賴于Mg2+由 Ca2+激發(fā)。較低活性的 AC在加入植物黃萎病致病菌后,AC活性瞬間升高了3倍。AC活性的短暫性升高同時(shí)伴隨著細(xì)胞內(nèi) cAMP含量升高,隨后磷酸二酯酶活性快速升高。

1.2 磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)

磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)負(fù)責(zé)降解細(xì)胞內(nèi) cAM P,目前已知有 40種以上 PDE,可分為七類。某些組織中AC基礎(chǔ)活性很高,這時(shí)PDE在調(diào)節(jié)cAMP信號(hào)途徑中的作用就很重要了。除了可以活化已有的 PDE酶類, cAMP也誘導(dǎo)合成新的 PDE mRNA,但目前這種調(diào)控節(jié)的分子機(jī)制尚未明了。

早在高等植物中提取環(huán)核苷酸混合物的報(bào)道之前,Wood[12-13]在豌豆苗種發(fā)現(xiàn)cAMP被PDE水解成AMP,隨后在煙草、胡蘿卜葉、大麥種子、馬鈴薯、洋姜塊莖中發(fā)現(xiàn)了 PDE的活性。諸多的研究表明,cAMP是植物組織中內(nèi)源性物質(zhì),其擁有的功能與其他生物體中類似。與此不同的是,Lin等[14]在豌豆苗中發(fā)現(xiàn)PDE活性具有最佳pH,并且對(duì)甲基黃嘌呤不敏感,水解得到3'-AMP而不是5'-AMP。更重要的是,把RNA分解中間物2',3'-cAMP作為底物而不是第二信使系統(tǒng)中的3',5'-cAMP。因?yàn)樵趧?dòng)物體中PDE作用于cAMP第二信使系統(tǒng)只產(chǎn)生5'-AMP并不水解2',3'-cAMP,由此推斷出豌豆中的PDE并不在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用,只是作為RNA分解代謝的一部分。

1.3 蛋白激酶 A(cAMP-dependent protein kinase A,PKA)

PKA全酶是一種四聚體,由兩個(gè)催化亞基(C)和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基(R)構(gòu)成。在沒有 cAMP時(shí),以鈍化復(fù)合體形式存在。cAMP與調(diào)節(jié)亞基結(jié)合,改變調(diào)節(jié)亞基構(gòu)象,使調(diào)節(jié)亞基和催化亞基解離,釋放出催化亞基。活化的蛋白激酶A催化亞基可使細(xì)胞內(nèi)某些蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化,于是改變這些蛋白的活性,進(jìn)一步影響到相關(guān)基因的表達(dá)。

在真核生物中,cAMP的功能主要是由蛋白激酶對(duì)靶蛋白的磷酸化實(shí)現(xiàn)的。但近來又有實(shí)驗(yàn)證明cAMP 可以直接作用于離子通道。目前,植物細(xì)胞中的研究主要集中在對(duì) cAMP依賴型蛋白激酶的查尋上。雖然尚未從植物組織中純化出 cAMP依賴的蛋白激酶 A,但在多種植物的提取物中證明依賴于cAMP磷酸化作用是存在的,如浮萍、玉米、椰子和水稻等[15-17]。現(xiàn)已在幾種植物中發(fā)現(xiàn)有類似動(dòng)物PKA 的調(diào)節(jié)亞基(即 cAMP 的結(jié)合蛋白)和催化亞基。而且近年來報(bào)道的幾個(gè)植物蛋白激酶基因與動(dòng)物中PKA和蛋白激酶C (protein kinase C,PKC)催化亞基高度同源[17-18]。雖然植物與動(dòng)物PKA 的催化亞基相似,cAMP 能激活 PKA 的催化亞基,但并不能完成調(diào)節(jié)亞基的抑制作用,所以植物體內(nèi)可能還需其他酶的協(xié)助功能完成PKA 的調(diào)節(jié)功能。

1.4 cAMP調(diào)控的離子通道(cyclic nucleotide-gated channels)

在植物中建立以蛋白激酶A為主要目標(biāo)和因素研究環(huán)核苷酸信使系統(tǒng)存在一定的困難,植物中cAMP調(diào)控的離子通道(CNGCs)是研究環(huán)腺苷酸信使系統(tǒng)的理想體系[19]。CNGCs是許多植物中一組運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)的離子通道,另外其只由環(huán)腺苷酸激活。擬南芥CNGCs中就存在至少20種基因[20]。

通過對(duì)CNGCs的功能分析發(fā)現(xiàn),擬南芥中胞外高濃度的 Ca2+抑制 K+的運(yùn)動(dòng)來調(diào)控 K+、Ca2+和其他一價(jià)陽離子的運(yùn)動(dòng),并且對(duì) K+、Ca2+的調(diào)控都依賴于cAMP和cGMP[21]。除此之外,植物CNGCs含有相同的鈣調(diào)蛋白結(jié)合域(CaMBD),但是不同的CNGCs擁有不同的鈣調(diào)蛋白結(jié)合能力[22]。然而鈣調(diào)蛋白與CNGCs的結(jié)合依賴于Ca2+并由cAMP激活。因此,Ca2+與鈣調(diào)蛋白和環(huán)核苷酸的相互作用彼此相關(guān)聯(lián),另外CNGCs與胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白和環(huán)核苷酸信號(hào)共同形成胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

環(huán)核苷酸和離子通道共同參與了植物體內(nèi)眾多生理活動(dòng)。根據(jù)Kurosaki[23]的研究顯示,cAMP直接調(diào)控K+通道,K+受cAMP激發(fā)流入胡蘿卜細(xì)胞內(nèi)同時(shí)伴隨著 Ca2+的快速轉(zhuǎn)移,此外還有進(jìn)一步的研究顯示出cAMP和cGMP在調(diào)控氣孔開啟具有一定的作用,這涉及了多組離子通道。雙丁酰cAMP引起百合花粉管中胞內(nèi) Ca2+濃度的升高,光解釋放 cAMP使花粉管頂端彎曲,并使儲(chǔ)存Ca2+的釋放。Ca2+的分布遷移是控制頂端生長的一個(gè)重要原因,而 cAMP是調(diào)節(jié) Ca2+分布的主要因素[24]。這些通道涉及的離子運(yùn)動(dòng)是否是CNGCs還不能確定,cAMP是直接或是間接影響離子通道的活性,影響它們的磷酸化也尚不明確,這些都需要進(jìn)一步的研究。

2 cAMP的生理功能

在植物界中,對(duì)海藻的研究給我們提供了較好的研究 cAMP生理功能的材料,例如 cAMP調(diào)控衣藻(Chlamydomonas eugametos)有性生殖和纖細(xì)裸藻的生理節(jié)奏。在海藻的研究中發(fā)現(xiàn) cAMP的合成和分解機(jī)理,最近已經(jīng)從纖細(xì)裸藻(Euglena gracilis)中成功克隆 cAMP蛋白激酶基因[25]。盡管植物細(xì)胞中cAMP信號(hào)系統(tǒng)的某些成分在基因水平上尚未分離,但研究表明cAMP具有多種生理功能。與cAMP相關(guān)的生理功能的相繼發(fā)現(xiàn),為植物細(xì)胞中存在cAMP信號(hào)途徑積累了越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

細(xì)胞內(nèi)cAMP的變化及cAMP相關(guān)酶生理作用的報(bào)告顯示,植物當(dāng)中大量的生理活動(dòng)都與 cAMP的變化有關(guān)[26-28]。人們發(fā)現(xiàn) cAMP在多種植物生理活動(dòng)發(fā)揮作用例如離子傳輸。cAMP在葉綠體中也顯示具有重要的作用,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn) cAMP在該細(xì)胞器中完整的運(yùn)行機(jī)制。

2.1 調(diào)節(jié)植物細(xì)胞生理周期

研究發(fā)現(xiàn),cAMP在眾多生理過程中發(fā)揮極其重要的作用。Ehsan[29]報(bào)道cAMP與煙草BY-2細(xì)胞的細(xì)胞分裂周期密切相關(guān)。細(xì)胞在S期時(shí),cAMP的含量達(dá)到最高在G1期時(shí)含量相對(duì)較低。在加入吲哚美辛(一種腺苷酸環(huán)化酶抑制劑)之后[30],引起細(xì)胞S期cAMP含量的降低,并伴隨減弱細(xì)胞的有絲分裂。作者認(rèn)為在細(xì)胞分裂過程中存在一種前列腺素或前列腺素類似物(素馨酮酸)激活腺苷酸環(huán)化酶。

越來越多的研究顯示 cAMP在動(dòng)物及真菌細(xì)胞分裂周期中發(fā)揮重要作用。cAMP含量在連續(xù)的細(xì)胞分裂周期中發(fā)生變化,在不同細(xì)胞類型中 cAMP顯示出具有刺激或抑制細(xì)胞增值的作用。在細(xì)胞 S期之前,cAMP含量的瞬時(shí)升高是引起DNA合成的原因之一。這說明 cAMP作用于細(xì)胞分裂過程中重要的細(xì)胞分裂調(diào)解素。釀酒酵母細(xì)胞分裂周期也受到Ras/cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的高度調(diào)控[31]。

cAMP在調(diào)節(jié)纖細(xì)裸藻(Euglena gracilis)細(xì)胞生理節(jié)奏發(fā)揮重要的作用[32-33]。Edmunds[34]認(rèn)為通過G1/S和G2/M的協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)變從而形成生物鐘和細(xì)胞分裂周期之間的聯(lián)系。一項(xiàng)腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶的研究顯示,AC活性的變化受到其酶活性調(diào)節(jié)器的調(diào)節(jié)而不受酶數(shù)量的影響。在白天的任何時(shí)候加入毛喉素(forskolin)都能最大程度的激活腺苷酸環(huán)化酶活性,此外還能減小 cAMP含量變化的幅度以及減少細(xì)胞分裂過程中的節(jié)律性。IBMX的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)磷酸二酯酶活性受時(shí)間段的抑制。然而,IMBX也是各種磷酸二酯酶活性的抑制劑,只是程度上各不相同而已。正是由于這個(gè)原因?qū)е录?xì)胞周期中存在各種磷酸二酯酶,其中某種特別的磷酸二酯酶可能是cAMP變化產(chǎn)生的原因。

在研究生物鐘影響cAMP含量的過程中,Tong[35]研究了Ca2+、鈣調(diào)蛋白、三磷酸肌醇和 cGMP在腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶中的調(diào)節(jié)作用。cGMP含量的變化先與 cAMP含量變化。cGMP及其類似物同樣對(duì)腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶存在一定的影響。因此可以看出cGMP是cAMP代謝的調(diào)節(jié)者。

cAMP對(duì)細(xì)胞分裂周期產(chǎn)生的影響主要是延緩或加速細(xì)胞周期。在細(xì)胞生物鐘的白天時(shí)段加入cAMP會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂周期的延緩,而在夜晚時(shí)段加入 cAMP則會(huì)加速細(xì)胞分裂周期的循環(huán)。這主要是由于細(xì)胞中存在多種不同的 cAMP受體選擇性的調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)調(diào)控途徑所致。在纖細(xì)裸藻中發(fā)現(xiàn)兩種cAMP蛋白激酶(cPKA和cPKB)與cAMP及其類似物聯(lián)系各不相同[36]。通過 Edmunds[34]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),cAMP含量的增加會(huì)抑制DNA的合成,使細(xì)胞分裂停留在G2期,因此抑制了細(xì)胞分裂。當(dāng)cAMP含量減少的時(shí)候,對(duì)細(xì)胞分裂的抑制現(xiàn)象消失了。我們推測(cè)細(xì)胞分裂周期從G2到M的轉(zhuǎn)變及整個(gè)有絲分裂過程都受 cAMP的影響。cAMP對(duì)細(xì)胞分裂周期的延緩作用受 cPKA調(diào)控,對(duì)細(xì)胞周期的加速作用則由cPKB調(diào)控。由此可見,cPKA和cPKB在細(xì)胞分裂周期中的表達(dá)有所不同,至于在什么時(shí)段表達(dá)什么蛋白激酶還在研究當(dāng)中[37]。

2.2 參與植物抗病

許多研究顯示植物在抗病毒過程中受 cAMP的調(diào)控。這種應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)和動(dòng)物第二信使系統(tǒng)中的胞外信號(hào)、信號(hào)受體、及其反應(yīng)機(jī)制類似[38]。已發(fā)現(xiàn)多種胞外誘導(dǎo)子,包括多糖、低聚糖、脂肪酸、蛋白質(zhì)和糖蛋白;另外還發(fā)現(xiàn)了少數(shù)信號(hào)受體,都是一些分布在細(xì)胞質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)。信號(hào)受體對(duì)外界刺激做出的反應(yīng)的同時(shí)激活特殊的防御反應(yīng)基因,并誘導(dǎo)植物抗毒素的合成酶的產(chǎn)生。細(xì)胞質(zhì)膜這種接收信號(hào)的機(jī)制轉(zhuǎn)接到核基因,已經(jīng)多方面的運(yùn)用到Ca、素馨酮酸、活性氧、甘油二酯和磷酸肌醇、cAMP[39]。

Oguni首次在甘薯中發(fā)現(xiàn) cAMP調(diào)控細(xì)胞防御體系合成植物抗毒素[40],之后在胡蘿卜中也發(fā)現(xiàn)植物抗毒素的增加伴隨著細(xì)胞內(nèi) cAMP含量的升高[41]。研究表明,cAMP參與了苜蓿(Medicago sativaL.)抗黃萎病合成植物抗毒素所作出的應(yīng)激反應(yīng)[42],苯基丙氨酸解氨酶(PAL)的活性也大幅提高催化植物抗毒素合成的前期反應(yīng)。經(jīng)過雙丁酰 cAMP處理的苜蓿幼苗苯基丙氨酸解氨酶活性提高,并促進(jìn)美迪紫檀素(medicarpin)的合成[43,11];通過 FAB/MIKE光譜分析發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)源性 cAMP在經(jīng)病原激發(fā)子處理后含量升高了 4～5倍。雖然在胡蘿卜細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了上面類似的現(xiàn)象,但是苜蓿幼苗經(jīng)病原激發(fā)子處理后3～5 min cAMP含量就達(dá)到了最高水平,而胡蘿卜則在 30 min后才體現(xiàn)出 cAMP含量的升高,四季豆需要15min達(dá)到最高反應(yīng)水平[44]。在苜蓿中,AC刺激反應(yīng)的增強(qiáng)和減弱都隨著磷酸二酯酶的變化而變化。胡蘿卜中霍亂毒素刺激其植物抗毒素的合成以及激發(fā)四季豆中苯基丙氨酸解氨酶的活性與都G蛋白有關(guān)[45]。

以上的研究顯示 cAMP與植物合成抗毒素反應(yīng)的過程,但是究竟如何調(diào)控植物抗毒素合成還不明確。AC對(duì)Ca2+的敏感性[11]以及cAMP對(duì)離子通道的調(diào)控作用[23],均顯示cAMP的作用是通過AC/cAMP和IP3/ Ca2+途徑的對(duì)話而起作用的。盡管在胡蘿卜細(xì)胞中沒有明顯的檢測(cè)到對(duì) cAMP響應(yīng)的蛋白激酶活性,但是Ca2+和鈣調(diào)蛋白可以快速激活。根據(jù)這些結(jié)果,我們可以推測(cè),病原激發(fā)子誘導(dǎo)的cAMP增加可引起 Ca2+的內(nèi)流,Ca2+再進(jìn)一步激活蛋白激酶的活性[24]。

2.3 對(duì)藻類有性生殖過程的調(diào)控

Pasquale等[46]在研究萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhaidtii)雌雄配子粘合過程中發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)cAMP含量短暫性的升高了10倍,在單一生殖性型配子中加入外源性雙丁酰 cAMP之后可以引起雌雄配子粘合時(shí)產(chǎn)生的相似反應(yīng),如細(xì)胞壁的消失,鞭毛頂端的激活等。并且加入環(huán)核苷酸磷酸二酯酶抑制劑后加強(qiáng)外源性 cAMP的促進(jìn)作用,在配子細(xì)胞和鞭毛中發(fā)現(xiàn)了腺苷酸環(huán)化酶的活性。類似的 Pijst[47]在研究卵配衣藻正負(fù)生殖型的配子混合在一起時(shí),在粘著發(fā)生20s后觀察到細(xì)胞內(nèi)cAMP含量快速升高,并且把一生殖型的配子中加入另一種生殖型的配子的離體的鞭毛時(shí)也能引起細(xì)胞內(nèi) cAMP數(shù)量的短暫性的升高。由于這種 cAMP濃度的提高先于細(xì)胞融合時(shí)所有形態(tài)學(xué)和生理學(xué)的改變,推測(cè)它可能是由性粘著誘導(dǎo)的第一個(gè)主要的反應(yīng)。Gilles[48]分別用結(jié)合蛋白實(shí)驗(yàn)和高效液相色譜法分析了團(tuán)藻性組織細(xì)胞中的cAMP含量比普通組織細(xì)胞中高,發(fā)現(xiàn)過高濃度的cAMP會(huì)抑制有性生殖的性誘導(dǎo),性組織的細(xì)胞僅當(dāng)結(jié)合時(shí),cAMP 濃度才會(huì)升高。在非誘雄性藻株中10倍或20倍的cAMP 濃度升高會(huì)導(dǎo)致其不育,由此可見 cAMP作為復(fù)雜的性誘導(dǎo)物質(zhì)中的一員在細(xì)胞基質(zhì)中發(fā)生作用。

3 cAMP含量變化機(jī)制的研究

cAMP系統(tǒng)的機(jī)能活動(dòng)的研究主要是通過對(duì)內(nèi)源性 cAMP含量的檢測(cè)來實(shí)現(xiàn)的。早前運(yùn)用較廣泛的是Gilman的蛋白結(jié)合檢測(cè)法,這種方法基于同位素標(biāo)記的 cAMP(8-3H-cAMP)與環(huán)核苷酸樣品共同競(jìng)爭(zhēng)特異結(jié)合蛋白,cAMP蛋白激酶就是這種特異蛋白之一[49]。放射免疫檢測(cè)法也是常用的方法,抗體結(jié)合過量標(biāo)記的抗原,通過檢測(cè)未標(biāo)記的抗原取代標(biāo)記的具有放射性的抗原的數(shù)量來計(jì)算 cAMP的含量。質(zhì)譜、高效液相色譜及其他生物熒光方法就顯得相對(duì)復(fù)雜,但是能較好地追蹤活體細(xì)胞中 cAMP的變化[50]。此外酶免疫檢測(cè)法則使用的相對(duì)更少,標(biāo)記與未標(biāo)記抗原共同競(jìng)爭(zhēng)多克隆抗體,反應(yīng)完全之后加入到含有堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體的平板中,酶活力的大小就反映所檢測(cè) cAMP的濃度[51]。這些技術(shù)運(yùn)用得出的大量數(shù)據(jù)為植物體內(nèi) cAMP系統(tǒng)的研究積累了充足的證據(jù)。

cAMP作為第二信使并能引起相應(yīng)的反應(yīng)在植物細(xì)胞中普遍存在,當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí),胞外信號(hào)分子首先與受體結(jié)合形成復(fù)合體,然后激活細(xì)胞膜上的 Gs-蛋白,被激活的 Gs-蛋白再激活細(xì)胞膜上的腺苷酸環(huán)化酶(AC),催化 ATP脫去一個(gè)焦磷酸而生成 cAMP。生成的 cAMP作為第二信使通過激活PKA(cAMP依賴性蛋白激酶),使靶細(xì)胞蛋白磷酸化,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng),cAMP最終又被磷酸二酯酶(PDE)水解成5’-AMP而失活。AC和PDE可以從兩個(gè)不同方面調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度,從而影響細(xì)胞、組織、器官的功能。當(dāng)AC的活性升高時(shí),cAMP濃度升高,當(dāng)PDE濃度增高時(shí),cAMP濃度降低。PDE對(duì)cAMP的調(diào)控,不僅取決于PDE的活化、抑制因素,還與細(xì)胞內(nèi)PDE的組成、亞細(xì)胞分布有關(guān)。

Goodenough[52]在研究cAMP對(duì)衣藻鞭毛雌雄配子粘合作用時(shí),發(fā)現(xiàn)雌雄配子粘合引起凝集素的相互作用,并最終導(dǎo)致 cAMP含量的升高。此外Kooijman[53]將麥胚凝集素加入到衣藻中促使雌雄配子鞭毛粘合,鞭毛上的錨蛋白(可能通過G蛋白)激活腺苷酸環(huán)化酶催化 ATP形成 cAMP。Francisco[54]在研究光調(diào)節(jié)幾種大型海藻(網(wǎng)地藻、石花菜、石莼)cAMP含量時(shí)發(fā)現(xiàn),這幾種海藻在紅光和遠(yuǎn)紅外光的照射下,并未發(fā)生光敏反應(yīng) cAMP含量有一定的升高,在白光照射下cAMP含量大幅升高,在一定范圍內(nèi) cAMP含量隨著光照強(qiáng)度升高而升高,因此他們推測(cè)其 cAMP含量的積累受光合效能的調(diào)節(jié),而不受光敏素的影響。由此可以看出,cAMP很大程度上受新陳代謝產(chǎn)生的 ATP的影響,而光合作用產(chǎn)生cAMP的前體例如ATP,但是cAMP含量的降低是否與ATP合成的抑制有關(guān)還不能確定。

4 小結(jié)

綜上所述 cAMP信使系統(tǒng)是生物體調(diào)控眾多生理過程的主要信息傳遞系統(tǒng),調(diào)節(jié)活動(dòng)過程中出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的 cAMP含量的變化,證明了 cAMP在調(diào)節(jié)機(jī)體整體活動(dòng)的協(xié)調(diào)性和精確性等方面所起的主要作用。目前對(duì)藻類細(xì)胞內(nèi)的 cAMP信使系統(tǒng)研究較少,只集中在幾種衣藻和單細(xì)胞微藻當(dāng)中;此外,對(duì)于 cAMP的研究只僅限于其含量變化,對(duì) cAMP的相關(guān)酶及其結(jié)合蛋白的研究則幾乎為零,因此對(duì)cAMP的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)行廣泛而系統(tǒng)的研究。除了檢測(cè)生理過程中cAMP和cAMP相關(guān)酶活性的波動(dòng)變化之外,對(duì)cAMP響應(yīng)的蛋白激酶、結(jié)合蛋白和他們的靶目標(biāo)將是今后研究的主要重點(diǎn)。另外,質(zhì)譜、生化分析、免疫組織化學(xué)技術(shù)、結(jié)合高壓冷凍技術(shù)及分子蒸餾法的運(yùn)用將有助于 cAMP和 cAMP結(jié)合位點(diǎn)的亞細(xì)胞定位,用細(xì)胞化學(xué)分析方法對(duì)AC酶進(jìn)行定位;采用分子生物學(xué)技術(shù)分析 AC和 PDE的基因結(jié)構(gòu),用反義或RNA干擾技術(shù)抑制這些酶控制的 cAMP瞬間升高變化,同時(shí)用 cAMP類似物調(diào)控激酶或cAMP 結(jié)合位點(diǎn)的活性等。

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