種玉婷，李文哲，鄭國香,李成毅，劉 爽

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，哈爾濱 150030）

隨著石油等化石燃料的枯竭，尋找可代替化石燃料的新能源成為世界各國科學(xué)家的首要任務(wù)。纖維素因其是地球上產(chǎn)量最大且經(jīng)濟環(huán)保的可再生能源物質(zhì)，對于緩解未來的能源危機有著重要意義[1－3]。

近年來，隨著纖維素生物降解機理研究的不斷深入，如何發(fā)揮降解過程中微生物之間的協(xié)同與微生物生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性作用成為木質(zhì)纖維素類物質(zhì)降解的研究熱點[4－5]。因而充分利用自然界微生物間的協(xié)同關(guān)系，直接從自然環(huán)境中篩選能夠降解木質(zhì)纖維素的復(fù)合菌系成為一個新的研究趨勢[6]。王偉東等以高溫期的堆肥樣品為材料，篩選構(gòu)建了一組木質(zhì)纖維素分解菌復(fù)合系，該復(fù)合系在50℃培養(yǎng)條件3 d就可使濾紙崩潰率達到90%以上[7－8]。崔詩法等從腐爛的枯枝落葉中分離到一組分解能力較強的纖維素分解復(fù)合系St－13[9]，該復(fù)合系5 d內(nèi)可使濾紙完全崩潰，液體培養(yǎng)到14 d時能夠分解玉米秸稈中85.27%的纖維素，總失重率為58.03%。這些都為加速復(fù)合系的研究以及天然纖維素資源的利用開辟了新的道路。

本研究以較難降解的稻稈為碳源，并控制培養(yǎng)溫度為35℃的中溫條件，篩選出一組稻稈降解率較高的復(fù)合系，命名為LZF－12。并探索了其生長特性和生長條件，為該菌系的進一步優(yōu)化提供了重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣來源

分別從森林、沼澤邊等多處不同地點采取土樣24份，分別命名為樣品1－24號，進行篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基

稻稈的預(yù)處理：先將稻稈浸泡在1%NaOH溶液中24 h，再用清水反復(fù)沖洗干凈，于50℃烘箱烘干后將其剪成長度約為1 cm左右。

分離培養(yǎng)基：NaCl 0.5%，酵母粉0.1%，蛋白胨0.5%，CaCO30.3%，經(jīng)處理的稻稈1%，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2 測定方法

1.2.1 纖維素分解菌群生長曲線的測定

用250 mL的錐形瓶裝入200 mL分離培養(yǎng)基,接入20 mL種子液,35℃靜置培養(yǎng)，每隔12 h取樣，用752型分光光度計測定600 nm時的吸光度，以未接菌的培養(yǎng)基作對照。

1.2.2 稻稈失重的測定

將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液用八層紗布過濾，然后用鹽酸和硝酸的混合液沖洗紗布中剩余物，以除去殘留的菌體和碳酸鈣，再用清水反復(fù)沖洗多次，最后置于烘箱中烘至恒重[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合菌系LZF-12的篩選

初次篩選時，取24份土樣分別接種于分離培養(yǎng)基中，定期跟蹤觀察濾紙變化，以濾紙崩解程度作為初期篩選的指標(biāo)。在濾紙降解的旺盛時期以10%的接種量將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中，如此反復(fù)轉(zhuǎn)接下去。以濾紙完全被降解掉所用的時間長短來衡量菌系的降解能力，多數(shù)樣品在傳代過程中因其對濾紙分解能力弱而被淘汰，而10和12號樣品因其良好的濾紙降解能力和穩(wěn)定的菌群特性被連續(xù)轉(zhuǎn)接下去，以稻稈作為主要碳源定向馴化后，經(jīng)過三十多次的傳代培養(yǎng)，最后獲得一組降解效果較好且穩(wěn)定的菌系，命名為LZF－12。

2.2 復(fù)合菌系LZF-12的形態(tài)觀察

通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡對復(fù)合菌系的生長形態(tài)進行了觀察。在低倍的光學(xué)顯微鏡下對培養(yǎng)7 d的菌液進行觀測，發(fā)現(xiàn)（見圖1－A）復(fù)合系LZF－12主要由桿菌組成，且菌體密集。這表明此時菌群代謝旺盛，消耗底物的速率也相對較快。由于不同的復(fù)合菌系自身菌群的多樣性不同，往往表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征。如劉震東等[10]獲得的高溫降解纖維素復(fù)合菌系主要是由長桿菌構(gòu)成。而培養(yǎng)發(fā)酵中期的樣本在電子顯微鏡的放大結(jié)果顯示，LZF－12的菌群組成比較復(fù)雜，從外觀形態(tài)來看，粗細(xì)、長短不一，從數(shù)量上看桿菌占優(yōu)勢。同時，桿菌之間夾雜著少量的球狀菌、梭狀菌和啞鈴狀菌等，如圖1－B標(biāo)注。這表明，LZF－12中的菌群多樣，菌系彼此共生在同一個環(huán)境中。

圖1 LZF-12發(fā)酵中期的形態(tài)特征Fig.1 Conformation character of LZF-12 in mediumterm fermentation

2.3 復(fù)合菌系LZF-12的生長特性

2.3.1 LZF－12的生長曲線

以稻稈為主要碳源培養(yǎng)復(fù)合菌系LZF－12，600 nm下測定的生長曲線見圖2。微生物經(jīng)過1～5 d的對數(shù)生長期后達到最高值，OD600值為3.107，之后又開始下降，從7 d開始OD600呈現(xiàn)平穩(wěn)狀況，其值變化很小。由圖2可知，復(fù)合系從初始到峰值大致可分為三個增殖階段，其增殖速率依次下降。在接種后的前24 h復(fù)合系呈快速生長狀態(tài)，24 h后其增長速度明顯下降，而由后面試驗可知，培養(yǎng)基的溶解氧也是在24 h內(nèi)快速下降到最低值的，由此可推斷復(fù)合系的總體活性很有可能跟培養(yǎng)基內(nèi)的溶解氧有關(guān)系，當(dāng)復(fù)合系中的好氧菌將培養(yǎng)基中95%以上的氧消耗盡時，所形成的微好氧環(huán)境必定會抑制好氧菌的生長，致使復(fù)合系的總體增殖速度下降。從圖2中曲線我們可以看出在72 h左右又出現(xiàn)一轉(zhuǎn)折點，從72到120 h左右為復(fù)合系增殖的最后階段，由曲線傾斜度可知該階段微生物數(shù)量增加緩慢，而這一時間段與試驗中復(fù)合系對濾紙的快速降解階段相吻合，可能是該時間段復(fù)合系開始利用培養(yǎng)基中較難利用的纖維素類物質(zhì)所致。隨著結(jié)構(gòu)復(fù)雜的纖維素類物質(zhì)被降解成易利用的低糖類成分，發(fā)酵液內(nèi)微生物的數(shù)量反而下降，這可能是由于復(fù)合菌系在消耗碳源的同時，產(chǎn)生了大量的揮發(fā)酸等產(chǎn)物，隨著這些產(chǎn)物的積累，反饋抑制了微生物體內(nèi)相應(yīng)酶的活性，從而影響微生物菌群的生長。該階段，復(fù)合系對稻稈的分解與對培養(yǎng)基中各種酸類物質(zhì)的降解達成一個動態(tài)平衡的狀態(tài)，故其生長曲線顯示出較平穩(wěn)的狀態(tài)。

圖2 復(fù)合菌系LZF-12的生長曲線Fig.2 Growth curve of complex system LZF-12

2.3.2 發(fā)酵液的DO值變化

以10%的接種量將復(fù)合系接種于分離培養(yǎng)基中，35℃靜置培養(yǎng)。每24 h測其DO值（見圖3）。新鮮分離培養(yǎng)基DO值為2.3 mg·L-1左右，含氧量較為豐富。由圖3可以看出在接菌后的二十幾個小時內(nèi)，DO值由初始的2.3 mg·L-1急劇下降到0.07 mg·L-1，之后瓶內(nèi)DO值基本都維持在0.07～0.09 mg·L-1之間，在192 h之后又開始緩慢下降，到發(fā)酵結(jié)束后其DO值為0.05 mg·L-1左右。在發(fā)酵的初期，溶氧的急劇下降說明該菌系有好氧性菌株存在，當(dāng)DO值降至0.07 mg·L-1的微好氧環(huán)境時，體系內(nèi)的好氧菌的生長受到抑制。在此后的培養(yǎng)中，培養(yǎng)基一直處于微好氧環(huán)境，而且試驗復(fù)合系對濾紙的快速降解過程也是在這樣的環(huán)境中完成的，這說明微好氧的環(huán)境更適合該菌系對木質(zhì)纖維素物質(zhì)的降解，而復(fù)合系中的好氧菌在前期快速消耗體系內(nèi)的溶解氧，為微好氧菌的增殖和降解提供了有利的環(huán)境。二者的有機配合共同促進了復(fù)合系對木質(zhì)纖維類物質(zhì)的降解。

圖3 發(fā)酵過程中的DO值的變化Fig.3 Change of DO value in fermentation

2.3.3 不同初始pH對發(fā)酵體系內(nèi)pH變化的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH調(diào)到4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，接種量為10%，35℃條件靜置培養(yǎng)，每24 h監(jiān)測反應(yīng)體系內(nèi)的pH值。結(jié)果見圖4。

圖4 不同初始pH下發(fā)酵液的pH變化Fig.4 Changes of ferment liquid pH with different initial pH

由圖4可見，不同初始pH的各試驗組，接種后其發(fā)酵液內(nèi)的pH均有向中性靠攏的趨勢，pH為4～5的發(fā)酵液在24 h時回升到6左右，其余的發(fā)酵液均在24 h時維持在7左右，在之后的48 h內(nèi)各發(fā)酵液的pH基本沒有變化，從100 h左右起，各發(fā)酵液的pH呈緩慢上升趨勢。由此可見，復(fù)合系表現(xiàn)了很強的pH調(diào)節(jié)能力，總的規(guī)律是先將pH調(diào)到中性或微酸性，在此階段，復(fù)合系先利用培養(yǎng)基中容易消化的糖類物質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)變成有機酸，從而導(dǎo)致pH的下降。隨著產(chǎn)生的有機酸被分解或轉(zhuǎn)化后，pH又開始緩慢回升，這與復(fù)合系對底物的利用相吻合。

2.4 復(fù)合菌系LZF-12的降解特性觀察

2.4.1 LZF-12的濾紙降解特性

復(fù)合菌系LZF-12降解濾紙的表觀現(xiàn)象表明，在濾紙崩潰的整個過程中，前期降解速度較慢，如圖5-a～b所示，接菌后的前3 d濾紙變化不明顯，84 h左右時開始觀察到濾紙變軟變薄，而在之后的培養(yǎng)中濾紙降解明顯加快。可以清楚的看到從液面下1 cm處至底端的濾紙降解非常明顯，到100 h左右時濾紙從液面下1 cm處斷裂浸入到培養(yǎng)基中，在120 h左右時斷裂的濾紙完全被降解掉。復(fù)合菌系LZF-12內(nèi)的菌群在前期生長過程中，先利用培養(yǎng)基中較易利用的營養(yǎng)成分進行快速繁殖，到84 h以后菌群利用濾紙現(xiàn)象逐漸明顯，自身菌群繁殖速度達到一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，直至120 h左右濾紙完全被消耗。

圖5 復(fù)合菌系LZF-12降解濾紙的過程Fig.5 Course of filter paper degradation by complex system LZF-12

2.4.2 LZF-12的稻稈降解特性

本組試驗是選用數(shù)根稻稈莖，用細(xì)繩將其捆綁一起置于培養(yǎng)基中。圖6-A和B分別是稻草葉面經(jīng)復(fù)合菌系作用前后的掃描電子顯微照片，對比發(fā)現(xiàn)，對照（A圖）的細(xì)胞排列整齊、規(guī)則平整，而B中經(jīng)菌作用后的葉片表面的表皮細(xì)胞、硅化/木栓細(xì)胞列等已經(jīng)被破壞和撕裂開，結(jié)構(gòu)破壞明顯，細(xì)胞表面的蠟質(zhì)層也被破壞掉，有利于細(xì)菌的侵入。由圖6-C可知，在復(fù)合系LZF-12的作用下，稻莖中起粘連和支撐作用的薄壁組織在復(fù)合系的作用下被降解掉，導(dǎo)致7天左右稻稈便軟化浸入培養(yǎng)基中。圖6-D顯示，復(fù)合菌系已經(jīng)完全侵入稻草的內(nèi)部結(jié)構(gòu)組織，破壞維管組織周圍的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使包裹其中的大維管束裸露并呈現(xiàn)出來，同時可以清晰的看到菌群已經(jīng)大量的在維管組織及其他組織細(xì)胞之間生存集聚，從而加劇對底物稻草的破壞程度和速度，見圖6-D所標(biāo)示。

2.4.3 不同培養(yǎng)條件對復(fù)合系降解效果的影響

將復(fù)合菌系分別置于靜置和搖床條件下培養(yǎng)，溫度均為35℃，搖床轉(zhuǎn)速為100 r·min-1。280 h后測稻稈的失重。從圖7可以看出，從整個發(fā)酵過程來看，兩條曲線的變化趨勢比較相似，在接種后的前70 h內(nèi)降解速率比較快，可能是復(fù)合系先利用稻稈中的糖類、果膠類物質(zhì)，待將包裹其中的半纖維素、纖維素類物質(zhì)釋放出來，開始誘導(dǎo)相關(guān)的酶系從而對其降解，由于纖維素類物質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，所以降解速度也相對慢些。整個過程中，搖床條件下的稻稈失重率始終高于靜置條件下的，但最終的降解率又非常接近，分別為64.94%和62.84%，這與前文所說的微好氧環(huán)境更適合復(fù)合系對纖維素物質(zhì)的降解似乎有矛盾，其實不然，由于瓶口密封較好，且搖床轉(zhuǎn)速也較低，所以瓶中溶氧并沒有太大提高，倒是搖床條件下瓶中營養(yǎng)物質(zhì)混合均勻，更有利于復(fù)合系的吸收利用?？紤]到搖床條件下在后期的發(fā)酵中會消耗較大能量，選擇在靜置條件下對復(fù)合系進行馴化培養(yǎng)。

圖6 復(fù)合菌系LZF-12降解稻草的表觀特征Fig.6 Apparent character of straw degredating by LZF-12

圖7 不同培養(yǎng)條件下復(fù)合系對稻稈的降解能力Fig.7 Capacity of degradation under different culture condition

3 討論

稻稈是一種較難被降解利用的天然纖維素類物質(zhì)，經(jīng)堿處理的稻稈其纖維素、半纖維素、木質(zhì)素總含量占70%左右，纖維類含量較高。纖維素的降解是在幾種不同的酶的協(xié)同作用下完成的，參與降解的酶系屬于誘導(dǎo)型，因此復(fù)合系先利用培養(yǎng)基中容易利用的碳源進行增殖，待將其消耗殆盡時開始誘導(dǎo)降解纖維素的酶系，否則較高的易利用碳源濃度會抑制纖維素酶的合成[11-13]。復(fù)合系LZF-12對濾紙的降解過程也體現(xiàn)了這一點，即復(fù)合系LZF-12先利用培養(yǎng)基中容易利用的碳源進行增殖，大約在接種后前70 h左右，這時瓶中濾紙基本無變化，當(dāng)復(fù)合系達到一定數(shù)量、易利用的碳源被消耗掉時，開始誘導(dǎo)復(fù)合系產(chǎn)生降解纖維素類物質(zhì)的相關(guān)酶系，從而對濾紙進行降解。

在復(fù)合系LZF-12的作用下，7 d左右稻稈被破壞明顯，起支撐和粘連作用的薄壁組織基本被降解掉，暴露出更難降解的維管束類結(jié)構(gòu)，通過觀察復(fù)合系對濾紙和稻稈的降解可知，起降解作用的主要是其中的微好氧菌，這對于復(fù)合系培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化提供了重要參考價值。本研究只對稻稈的表觀變化進行觀察，對于其降解率及發(fā)酵過程產(chǎn)物分析還有待于進一步探討。

4 結(jié)論

a.通過以稻稈為碳源并在中溫35℃培養(yǎng)的定向馴化，從24組原始土樣中成功篩選出一組稻稈降解率較高且相對穩(wěn)定的復(fù)合菌系，命名為LZF-12。該復(fù)合菌系6 d內(nèi)即可將濾紙完全降解，7 d即可軟化稻稈。

b.LZF-12復(fù)合系由好氧菌株和微好氧菌株構(gòu)成，好氧菌通過消耗培養(yǎng)基溶解氧為微好氧菌營造適宜環(huán)境，而木質(zhì)纖維物質(zhì)的降解主要依靠微好氧菌。與靜置條件相比，低轉(zhuǎn)速搖床下培養(yǎng)基中物質(zhì)混合均勻，稻稈降解率也較高。

c.不同初始pH條件下，復(fù)合菌系發(fā)酵過程的環(huán)境pH變化趨勢基本一致，表明該菌系對環(huán)境pH的變化具有較強的緩沖調(diào)節(jié)能力。

[1] 孫寶魁,王東偉.高效穩(wěn)定纖維素分解混合菌群的篩選及分解特性研究[J].環(huán)境科學(xué)與管理學(xué)報,2008,33(9)：116-119.

[2] Schubert C.Can biofuels finally take center stage[J].Nat Biotechnol,2006,24(7)：777-784.

[3] 許修宏,肖玉珍,陳建平,等.高效纖維素分解菌分離篩選的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1998,29(4)：330-333.

[4] Lu W J,Wang H T,Yang S J,et al.Isolation andcharacterization of mesophilic cellulose-degrading bacteriafrom flower stalks-vegetable waste co-composting system[J].2005,51:353-360.

[5] Masahiro K,Nozomi I,Toshiaki K.Biological.Pretreatment with two bacterial strains or enzymatic hydrolysis of office pape[J].Current Microbiology,2007,54：424-428.

[6] Kondoh M.Foraging adaptation and the relationship between foodweb complexity and stability[J].Science,2003,299：1388-1391.

[7] 王偉東,王小芬,高麗娟,等.高效穩(wěn)定纖維素分解菌復(fù)合系WSC－6的篩選及其功能[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報,2005,17(3)：14-17.

[8] ?？×?崔宗均,李國學(xué),等.高效纖維素降解菌復(fù)合系的篩選構(gòu)建及其對秸稈的分解特性[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2005,24(4)：795-799.

[9] 崔詩法,廖銀章,黎云祥,等.纖維素分解復(fù)合菌系St-13的篩選及產(chǎn)酶條件的研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,16(1)：8-11.

[10] 劉震東,李文哲,劉爽,等.高效木質(zhì)纖維素分解菌復(fù)合系的發(fā)酵特性[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,40(8)：105-109.

[11] Odenyo A A,Biahop R,Asefa G.Isolation and characterisa-lion of anaerobic cellulose-degrading bacteria from East African porcupine(Hystrix cristata)[J].Anaerobe,1999(5)：93-100.

[12] Schwarz W H.The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria[J].Appl Microbiol Biotechnol,2001,56：634-649.

[13] 張宇,卓依婷，許敬亮,等.高效纖維素降解菌的篩選及其系統(tǒng)發(fā)育分析[J].太陽能學(xué)報,2009,30(1)：103-106.