李英軍，熊善高，魏自民*，張 斌，白 雪

（1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 100012；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

在適宜的環(huán)境下，磷的釋放主要取決于無機(jī)磷的解吸和有機(jī)磷的礦化。微生物對(duì)有機(jī)磷的礦化降解是沉積物向上覆水體中釋放磷的一種重要方式。國外有許多研究聚焦于有機(jī)磷如何轉(zhuǎn)化為無機(jī)態(tài)的正磷酸鹽[1-2]。堿性磷酸酶是一種胞外酶，能催化有機(jī)磷的水解反應(yīng)，使有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷，提高磷的生物可利用性。它是一種專一性較廣的磷酸水解酶，可以催化所有的磷酸酯的水解反應(yīng)和磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在生物體內(nèi)具有非常重要的生理功能。它直接參與磷代謝，并與DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等代謝有關(guān)，它對(duì)磷酸鈣的沉積具有重要意義[3]。其主要是來源于細(xì)菌、浮游植物、浮游動(dòng)物[4-5]。Klotz發(fā)現(xiàn)一類可為堿性磷酸酶水解的有機(jī)磷能被溪流沉積物吸附或釋放。印度某海岸和港灣沉積物中磷酸酶的活性在夏季月出現(xiàn)高峰，這種現(xiàn)象與有機(jī)碎屑的大量沉積和礦化過程之間有某種聯(lián)系[6]。威尼斯瀉湖沉積物中堿性磷酸酶的活性正比于磷的釋放速率，且由間隙水中溶解活性磷的濃度調(diào)節(jié)[7]?？梢姡⑸镏饕峭ㄟ^分泌磷酸酶的方式，催化磷酸酯類有機(jī)化合物水解產(chǎn)生正磷酸鹽，完成對(duì)有機(jī)磷的礦化。

鏡泊湖為一河道型火山堰塞湖，位于中國黑龍江省牡丹江市境內(nèi)。該湖南北長41 km，平均寬2.33 km，湖面面積91.15 km2，最高水位可達(dá)海拔353.5 m，北部吊水樓，由于斷裂影響形成落差達(dá)12 m的瀑布，流出湖區(qū)入牡丹江[8]。湖區(qū)內(nèi)以林業(yè)為主，農(nóng)業(yè)、工業(yè)次之，漁業(yè)、旅游業(yè)近年有所發(fā)展。鏡泊湖主要功能為水源地，兼有旅游、養(yǎng)殖、發(fā)電、水運(yùn)、調(diào)節(jié)水量多種功能。

影響沉積物中磷釋放的因素有很多，如pH、溫度、容氧等，對(duì)此國內(nèi)已進(jìn)行了大量的研究。而微生物對(duì)沉積物中有機(jī)磷的礦化，特別是以東北地區(qū)湖庫沉積物為研究對(duì)象的研究則很少。本文通過室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)，初步探討微生物對(duì)沉積物中有機(jī)磷礦化的過程，旨在進(jìn)一步認(rèn)識(shí)微生物在有機(jī)磷礦化中的作用，為預(yù)防湖泊富營養(yǎng)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方案

2010年10月用彼得遜泥樣采集器采集了鏡泊湖HJ6號(hào)樣點(diǎn)（見圖1）的表層沉積物，剔除植物和貝類等殘?bào)w，用聚乙烯保鮮袋運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并相應(yīng)采集了上覆水。將采集的鮮泥分別置于兩組3.3 L的塑料桶中，同時(shí)加入適應(yīng)的上覆水，并保持泥水比為1∶4，其中一組塑料桶中向上覆水加入氯仿滅菌，氯仿濃度為0.5%。兩組桶四周用黑色的塑料袋包裹，并置于遮光處，防止藻類的生長。每隔3 d取水樣和底泥鮮樣分析上覆水中總磷、溶解態(tài)總磷、溶解性磷酸鹽及沉積物中堿性磷酸酶、有機(jī)質(zhì)和有機(jī)磷的含量，實(shí)驗(yàn)周期為30 d。

圖1 鏡泊湖采樣點(diǎn)示意Fig.1 Map showing sampling sites of Jingbo Lake

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

水體中pH用pH電極測(cè)定，總磷、溶解性總磷、溶解性磷酸鹽采用鉬銻抗比色法測(cè)定[9]。沉積物中有機(jī)磷（Org-P）采用酸堿浸提法[10]，沉積物中堿性磷酸酶的測(cè)定參照土壤分析方法[10]。

圖2 水體中pH的變化Fig.2 Variation of pH in water

2 結(jié)果與分析

2.1 pH變化

湖水pH是湖泊及流域各種自然地理因素綜合作用的結(jié)果，pH被認(rèn)為是底泥與上覆水磷交換的重要因素。在對(duì)太湖沉積物磷釋放影響的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，沉積物磷釋放量隨pH升高呈“U”形曲線，即在中性條件下磷的釋放量最小，偏酸或偏堿都能促進(jìn)磷的釋放[11]。當(dāng)pH升高時(shí)，由于氫氧根與非晶體磷和鋁、鐵結(jié)合態(tài)磷交換作用加強(qiáng)，發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性吸附，容易發(fā)生離子交換，并從絡(luò)合態(tài)中解吸出來[12]。當(dāng)pH降低時(shí)，鈣、鐵結(jié)合態(tài)磷由于底質(zhì)有機(jī)物降解產(chǎn)生CO2使其溶解度增加，導(dǎo)致磷的釋放量增大[13]。礦化實(shí)驗(yàn)中水體pH的變化情況如圖2所示，未滅菌處理，在0～15 d內(nèi)pH逐漸下降，而在18 d時(shí)，其值上升，隨后又逐漸下降。對(duì)于滅菌處理，pH隨時(shí)間都表現(xiàn)為降低，從圖可知，無論是未滅菌處理還是滅菌處理，水體中pH都隨著時(shí)間而逐漸下降，其中經(jīng)過滅菌處理比未滅菌處理下降幅度更大。其值降低的原因可能是由于微生物在礦化過程中，分泌一些小分子的有機(jī)酸類物質(zhì)，從而引起水體pH下降，而對(duì)滅菌處理來說，菌體的自溶而產(chǎn)生大量的的有機(jī)殘?bào)w，這些有機(jī)物質(zhì)降解過程中也會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸。

2.2 上覆水中各形態(tài)磷的變化

由圖3所示，對(duì)于未滅菌處理，水體中TP的值在0～9 d內(nèi)有上升的趨勢(shì)，在12 d時(shí)稍有下降，隨后又逐漸上升，在30 d時(shí)上升到最大值。而對(duì)于經(jīng)過滅菌處理，TP的濃度總體表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)。生物作用對(duì)沉積物中磷的影響主要表現(xiàn)在無機(jī)磷的溶解和有機(jī)磷的礦化兩個(gè)方面上。經(jīng)過對(duì)比可得出，微生物的活動(dòng)對(duì)沉積物中磷的礦化和溶解有著重要的影響，未滅菌處理比滅菌處理中TP濃度更高，上覆水中TDP和DRP含量0～15 d呈現(xiàn)一定差異性，而在15～30 d內(nèi)，其含量均逐漸降低。未滅菌處理，TDP和DRP的濃度0～15 d內(nèi)逐漸上升的趨勢(shì)，表明微生物對(duì)沉積物中磷的影響逐漸加強(qiáng)，通過礦化和溶解形成的磷酸鹽逐漸釋放的水體中，而滅菌處理中，在0～15 d內(nèi)表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，其原因可能為微生物前期大量的死亡，產(chǎn)生生物殘?bào)w等有機(jī)物質(zhì)，和水中的磷酸鹽產(chǎn)生吸附沉淀作用，從導(dǎo)致水體中磷酸鹽濃度降低，隨后在pH逐漸下降的情況下，會(huì)導(dǎo)致一部分無機(jī)難溶性磷的溶解而釋放出磷酸鹽。15 d后，兩種處理水體中TDP和DRP濃度都降低，而TP未出現(xiàn)此種情況，其原因應(yīng)該是隨著實(shí)驗(yàn)的后期，礦化培養(yǎng)液逐漸減少，取樣過程中沉積物易懸浮，導(dǎo)致大部分磷以顆粒吸附態(tài)的形式存在，溶解性磷酸鹽的含量則逐漸減少。

圖3 上覆水中各形態(tài)磷的變化Fig.3 Variations of the concentrations of phosphorus in the overlying waters

2.3 堿性磷酸酶活性變化

一般認(rèn)為，堿性磷酸酶與有機(jī)磷的礦化作用關(guān)系更為密切，二者之間呈正相關(guān)關(guān)系。作為胞外酶，堿性磷酸酶大量存在于沉積物中，可以催化核苷、含糖磷酸酯和不飽和肌醇磷酸酯等較簡(jiǎn)單的含磷有機(jī)物盡快的水解脫磷酸。由圖4所示，未滅菌和滅菌處理隨時(shí)間其變化趨勢(shì)基本一致，呈現(xiàn)波浪形的波動(dòng)，二者只表現(xiàn)在含量大小的不同。其原因?yàn)閷?duì)于未滅菌的處理，微生物由于前期自身的生長會(huì)消耗營養(yǎng)物質(zhì)，隨著資源的耗竭，微生物生長受到影響，菌體破碎死亡，分泌堿性磷酸酶活性逐漸降低，到9 d時(shí)，微生物利用生物殘?bào)w大量繁殖，故分泌磷酸酶逐漸增多。有研究表明，堿性磷酸酶的合成有賴于環(huán)境中磷的營養(yǎng)狀態(tài)，當(dāng)磷酸鹽濃度＞0.20 mg·L－1時(shí)，堿性磷酸酶的活性則會(huì)顯著地減少[14]。由圖可知，在15 d時(shí)，上覆水中磷酸鹽濃度已達(dá)到最大值，對(duì)磷酸酶的合成會(huì)產(chǎn)生一定抑制作用，15～21 d，堿性磷酸酶活性逐漸減低，隨著水體中溶解性磷酸鹽含量逐漸的降低，其堿性磷酸酶活性表現(xiàn)在21～30 d內(nèi)又顯著增強(qiáng)。對(duì)于滅菌處理來說，前期滅菌作用，導(dǎo)致微生物大量死亡，而沉積物中少量的耐性菌體存活下來，表現(xiàn)在0～9 d內(nèi)分泌堿性磷酸酶活性逐漸減少，在中期，耐性菌由于逐漸適應(yīng)并大量繁殖，分泌磷酸酶的含量也逐漸增多，到后期，由于堿性磷酸酶合成受其他組分磷的影響，而表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)。

圖4 沉積物中堿性磷酸酶活性的變化Fig.4 Variation of alkaline phosphatase in sediment

2.4 沉積物中有機(jī)磷的變化

微生物對(duì)有機(jī)磷的影響，主要表現(xiàn)在一定的磷環(huán)境條件下，通過分泌胞外酶，分解有機(jī)磷，從而維持自身生長所需的能源和營養(yǎng)源。礦化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，結(jié)果表明，對(duì)于未滅菌處理，沉積物中有機(jī)磷的含量表現(xiàn)出一定的起伏，在礦化前期，其含量逐漸減少，主要原因是微生物對(duì)有機(jī)磷的礦化作用，使沉積物中的有機(jī)態(tài)磷轉(zhuǎn)化成無機(jī)態(tài)磷酸鹽，使有機(jī)磷的含量變小。在15 d時(shí)，含量逐漸上升，其原因很可能是由于微生物的作用明顯加強(qiáng)，從而對(duì)有機(jī)磷產(chǎn)生固定作用，即沉積物中存在大量能夠在體內(nèi)積累多聚磷酸鹽的微生物，這些微生物對(duì)水體中可溶性磷酸鹽進(jìn)行吸收轉(zhuǎn)化，以有機(jī)磷的形式存儲(chǔ)在體內(nèi)，從而使微生物量磷也成為有機(jī)磷的一部分，增大有機(jī)磷在總磷中的含量。在實(shí)驗(yàn)后期，其含量表現(xiàn)為“潮汐式”的回升和降落，微生物的活動(dòng)是其主要原因。對(duì)于滅菌處理，有機(jī)磷的含量在前期略有上升，其原因?yàn)樵谇捌?，由于滅菌的處理使生物殘?bào)w大量富集在沉積物中。在中后期，隨著時(shí)間的推移，有機(jī)磷有少量被礦化。相關(guān)分析表明兩種處理均與時(shí)間負(fù)相關(guān)，其中滅菌處理相關(guān)性較顯著（P＜0.05）。

圖5 沉積物中有機(jī)磷的變化Fig.5 Variation of organic phosphorus in sediment

3 討 論

在沉積物中，微生物的作用以細(xì)菌為主。細(xì)菌對(duì)沉積物中磷的釋放的影響包括直接和間接的兩個(gè)方面[15－16]。而有機(jī)磷作為直接分級(jí)的化合物，在微生物影響下，其變化最為明顯。

沉積物中微生物對(duì)有機(jī)磷的礦化是以微生物為中介來實(shí)現(xiàn)的：微生物利用含磷有機(jī)物中的碳以獲取能量，而磷則以代謝產(chǎn)物的形式釋放出來，這種礦化途徑稱為生物礦化。許多微生物都能分泌出磷酸酶，在它的酶促作用下，有機(jī)磷化合物被水解，釋放出磷酸鹽。當(dāng)水體中缺乏正磷酸鹽時(shí)，可在藻類及細(xì)菌體中誘導(dǎo)產(chǎn)生，催化有機(jī)磷的分解，釋放正磷酸鹽。這種轉(zhuǎn)化是生物可利用磷的重要補(bǔ)充途徑，尤其在以微生物為主體的湖泊沉積物生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用。分析表明，未滅菌和滅菌處理有機(jī)磷含量逐漸減少，但前者比后者減少的程度更大。未滅菌處理比滅菌處理堿性磷酸酶的含量要高些。

堿性磷酸酶與生物活性、磷濃度自己有著獨(dú)特的響應(yīng)機(jī)制。與磷營養(yǎng)水平之間呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系[17－18]。其活性通常僅出現(xiàn)在極低的磷酸鹽條件下[19]，而水體中磷含量高于某一濃度時(shí)，其活性則被抑制。堿性磷酸酶與水體中磷含量之間存在一定的“抑制－誘導(dǎo)”關(guān)系[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了此觀點(diǎn)。不同水生生態(tài)系統(tǒng)中，其閾值不同[14]。這說明了堿性磷酸酶與磷營養(yǎng)水平之間的響應(yīng)復(fù)雜，要想徹底的弄清二者相互影響的機(jī)制，還有待進(jìn)一步的研究，例如利用DGGE技術(shù)從微觀方面分析微生物分子結(jié)構(gòu)特征與酶類的互相關(guān)系。

4 結(jié)論

a.對(duì)未滅菌處理中TP的濃度，比滅菌處理中TP濃度要高，說明微生物促進(jìn)了沉積物中磷向水體的釋放，而兩種處理TDP和DRP的含量在實(shí)驗(yàn)后期都降低，表明實(shí)驗(yàn)后期沉積物中釋放的磷主要以顆粒態(tài)的形式存在于水體中。

b.兩種處理中堿性磷酸酶的變化趨勢(shì)基本一致，但未滅菌處理中堿性磷酸酶活性明顯增強(qiáng)，同時(shí)表現(xiàn)出與外界磷濃度的響應(yīng)關(guān)系。

c.礦化過程中，兩種處理有機(jī)磷含量都表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，與滅菌處理比較，未滅菌處理有機(jī)態(tài)磷礦化進(jìn)程明顯加快。

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