張曉烜，李景富，王傲雪

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)成棟學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

菌種選育是纖維素酶生產(chǎn)的基礎(chǔ)性工作，里氏木霉是產(chǎn)纖維素酶最好的菌種之一[1]。目前里氏木霉高產(chǎn)纖維素酶菌株的選育方式有：利用高能電子、紫外線、亞硝酸鈉、亞硝基胍、硫酸二乙酯處理和原生質(zhì)體融合等方法，使酶的活力得到很大的提高[2]。原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁，對誘變劑反應(yīng)靈敏，容易得到正突變株，是得到優(yōu)良菌種的有效方法。所以原生質(zhì)體的制備研究是有必要且有應(yīng)用價值的研究。

本文對影響里氏木霉（Trichoderma reesei）40359原生質(zhì)體制備和再生的條件：包括菌齡、水解酶液的種類及濃度、酶解溫度、酶解時間、再生培養(yǎng)基的穩(wěn)滲劑進(jìn)行了研究。得到了較好的里氏木霉原生質(zhì)體制備的條件，為進(jìn)一步的育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

里氏木霉（Trichoderma reesei）40359 購自于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌絲培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，蒸餾水定容至1 000 mL。

霉菌完全培養(yǎng)基（CM）：1.4 g（NH4）2SO4、5.0 g葡 萄 糖 、 2.0 g KH2PO4、 6.9 g NaH2PO4、 0.3 g MgSO4·7H2O、10.5 g檸檬酸（含兩個結(jié)晶水）、0.3 g尿素、0.2 g Tween-80、5 mg FeSO4·7H2O、1.6 g MnSO4、1.4 g ZnSO4·7H2O、2.0 mg CaCl2·2H2O、15%蛋白胨，用蒸餾水定容至1 000 mL。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：2.8 g（NH4）2SO4、0.6 g 尿素、4 g磷酸鉀、40 g葡萄糖、100 g蔗糖、600 mg CaCl2、200 mg MgSO4·10H2O、10 mg FeSO4·7H2O、1.8 mg ZnSO4·7H2O、3.2 mg MnSO4·H2O、4 mg CoCl2·6H2O，配制固體培養(yǎng)基時需加人瓊脂17～20 g，用蒸餾水定容至1 000 mL。

1.1.3 高滲透穩(wěn)定緩沖液（STC）

0.6 mol·L-1山梨糖醇，1×10-2mol·L-1Tris-HCl，1×10-2mol·L-1CaCl2，pH 7.5，用蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌絲的制備

在PDA上培養(yǎng)里氏木霉菌6 d，待綠色的分生孢子產(chǎn)生后，用無菌水洗下孢子，配成1×107個·mL-1孢子懸液，取1 mL加到菌絲培養(yǎng)液中，在30℃和轉(zhuǎn)速150 r·min-1條件下恒溫振蕩培養(yǎng)6～18 h。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備

取振蕩培養(yǎng)的菌絲培養(yǎng)液，用4層無菌紗布過濾收集菌絲體，用無菌水沖洗3次，STC沖洗至菌絲半透明，收集菌絲。稱取5 mg菌絲在25 mL小三角瓶中，加入10 mL新配制好的酶液，振蕩培養(yǎng)。用移液槍吸取STC在酶解三角瓶中，不斷的吸吹，沖散菌絲釋放原生質(zhì)體，用4層無菌的擦鏡紙過濾除去菌絲碎片，收集濾液置于小離心管中，3 000 r·min-1，離心5 min，收集原生質(zhì)體，再用STC反復(fù)洗滌3次，采用血球計數(shù)板計數(shù)，將濃度調(diào)到 1×106～7個·mL-1，懸浮于 STC 中在 4 ℃冰箱中保存。

1.2.3 原生質(zhì)體的再生

將制備的原生質(zhì)體用STC液稀釋至約1×103～1×106個·mL-1，每個稀釋度取0.1 mL 并涂再生平板。30℃，培養(yǎng)3 d計算菌落數(shù)。用無菌水對原生質(zhì)體稀釋成 1×103～1×106個·mL-1，劇烈震蕩，取稀釋液各0.1 mL，涂布于基本培養(yǎng)基，30℃，培養(yǎng)3 d計算菌落數(shù)，并計算再生率。再生率的計算方法如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 菌齡對原生質(zhì)體生成的影響

酶的作用受菌齡的影響，菌齡過長，菌絲細(xì)胞壁易發(fā)生老化增厚，不易于釋放原生質(zhì)體；過短則菌絲體易破裂，釋放原生質(zhì)數(shù)量較少[3]。本實驗選擇7個菌齡：6、8、10、12、14、16、18 h。由圖1可見，12 h釋放的原生質(zhì)體數(shù)最多，為6.11×105個·mL-1，其次為 10 h。

圖1 菌齡對原生質(zhì)體形成的影響Fig.1 Effect of fungus age on protoplast formation

2.2 細(xì)胞壁水解酶液種類及濃度對原生質(zhì)體生成的影響

水解酶的種類與濃度對原生質(zhì)體的形成有重要影響。一般來說，酶濃度越大形成的原生質(zhì)體越多，但是隨著酶濃度的不斷加大，但當(dāng)酶溶液達(dá)到一定濃度時，原生質(zhì)體形成數(shù)量就不再增加或增加不明顯。由表1可知，在纖維素酶和蝸牛酶的基礎(chǔ)上增加溶菌酶，對40359菌株破壁效果有一定的提高。從1號、3號、5號作用結(jié)果看，酶解相同時間，原生質(zhì)體數(shù)量隨酶液濃度加大而增加。所以，5號酶液即2.0%纖維素酶和2.0%蝸牛酶對40359破壁效果最好。得到的原生質(zhì)體數(shù)為6.13×105個·mL-1。

2.3 酶解時間對原生質(zhì)體形成的影響

酶解時間對原生質(zhì)體的質(zhì)量和產(chǎn)量影響較大。

充足的酶解時間是原生質(zhì)體化的必要條件。酶解時間過短,原生質(zhì)體形成不完全，酶解時間過長，原生質(zhì)體脫壁太完全，原生質(zhì)體的質(zhì)膜也易受到損傷，從而影響原生質(zhì)體的再生。本實驗用2%纖維素酶和2%蝸牛酶，設(shè)定酶解時間為0.5、1、1.5、2和2.5 h等5個時間組，定時取樣觀察原生質(zhì)體形成情況。結(jié)果表明（表2），隨著酶解時間的延長，原生質(zhì)體大量形成，酶解2.5 h時原生質(zhì)體的形成數(shù)量雖然在繼續(xù)增長，但是前期形成的原生質(zhì)體開始消解、變形，不利于原生質(zhì)體的再生。

表1 水解酶種類和濃度Table 1 Variety and concentration of hydrolytic enzyme

表2 酶解時間對原生質(zhì)體形成的影響Table 2 Effect of time of enzymic hydrolysis on protoplast forming

2.4 酶解溫度對原生質(zhì)體形成的影響

細(xì)胞壁水解酶受水解溫度影響較大，溫度不但影響著酶的活性，同時也影響著微生物的生理狀態(tài)。酶解溫度除了要考慮酶的最適溫度外，還要考慮原生體再生率。本試驗酶解溫度選擇26℃，28℃，30℃，32℃，34℃作用時間2 h。如圖3所示30℃時得到的原生質(zhì)體數(shù)最多，較高的酶解溫度會損傷原生質(zhì)體，使其釋放量降低（見圖3）。

2.5 不同穩(wěn)滲劑對原生質(zhì)體再生的影響

分別用 0.6 mol·L-1KCl、0.6 mol·L-1NaCl、0.6 mol·L-1蔗糖（Sugar）、0.6 mol·L-1甘露醇（Mannitol）、0.6 mol·L-1肌醇 （Inositol）、0.6 mol·L-1山梨糖醇（Sorbitol）作穩(wěn)滲劑加入到完全再生培養(yǎng)基中，將原生質(zhì)體稀釋成 1×105～6個·mL-1，吸取 0.1 mL 涂于再生平皿，30℃，培養(yǎng)3 d，計算再生率。由圖4可見，0.6 mol·L-1蔗糖作穩(wěn)滲劑，原生質(zhì)體的再生率高為8.4%。采用上述制備原生質(zhì)體的最佳條件試驗，結(jié)果原生質(zhì)體的形成數(shù)為6.14×105個·mL-1，再生率為10.2%。

圖3 酶解溫度對原生質(zhì)體形成的影響Fig.3 Effects of enzyme temperature on protoplast formation

圖4 不同穩(wěn)滲劑對原生質(zhì)體再生的影響Fig.4 Effects of different osmatic pressure stabilizers on protoplast regeneration

3 討論

微生物能否較好地形成原生質(zhì)體與許多因素有關(guān)，如：微生物所處的生理狀態(tài)，酶作用的時間，酶的種類、濃度，酶解時的溫度等等。所以在進(jìn)行原生質(zhì)體育種的準(zhǔn)備階段，一定要明確所用菌株的原生質(zhì)體形成條件，為后續(xù)工作打好基礎(chǔ)。

3.1 菌齡的選擇

不同種屬及同種屬微生物原生質(zhì)體的制備對菌齡的要求都存在著一定的差異。酶的作用受菌齡的影響，菌齡過長，菌絲細(xì)胞壁易發(fā)生老化增厚，不易于釋放原生質(zhì)體；過短則菌絲體易破裂，釋放原生質(zhì)數(shù)量較少[3]。曾大興研究表明[4]，較幼嫩的菌絲形成的原生質(zhì)體純度高、質(zhì)量好，隨著菌齡的增加，原生質(zhì)體的純度和質(zhì)量都下降，不同種屬的菌株所要求的菌齡不同。艾云燦等研究認(rèn)為里氏木霉的最佳菌齡為18～20 h[5]，崢嶸、張功的試驗則表明綠色木霉在培養(yǎng)11 h時獲得的原生質(zhì)體數(shù)量最多[6]。本試驗結(jié)果表明培養(yǎng)里氏木霉40359的最佳時間是12 h。

3.2 酶解種類與濃度

一般來說，酶濃度過低，不利于原生質(zhì)體的形成，酶濃度過高，則導(dǎo)致原生質(zhì)體再生率的降低。若原生質(zhì)體形成率很高，而其后的再生率很低，對于原生質(zhì)體育種來說是不大適合的。由于絲狀真菌的細(xì)胞壁組成較為復(fù)雜，有纖維素、幾丁質(zhì)等,要獲得較高的原生質(zhì)體得率，選擇適宜的水解酶系統(tǒng)非常重要。本試驗采用2%纖維素酶和2%蝸牛酶混合液效果好。

3.3 酶解時間的選擇

酶解時間對原生質(zhì)體的質(zhì)量和產(chǎn)量影響較大。充足的酶解時間是原生質(zhì)體化的必要條件。酶解時間過短，原生質(zhì)體形成不完全；酶解時間過長，原生質(zhì)體脫壁太完全，原生質(zhì)體的質(zhì)膜也易受到損傷，從而影響原生質(zhì)體的再生。徐敬友等認(rèn)為禾谷鐮孢菌在酶解2 h時細(xì)胞壁開始破裂，5 h左右原生質(zhì)體數(shù)量達(dá)到高峰后趨于穩(wěn)定[7]。本試驗結(jié)果表明，酶解時間在2 h原生質(zhì)體形成較好。

3.4 酶解溫度

細(xì)胞壁水解酶受水解溫度影響較大，溫度不但影響著酶的活性，同時也影響著微生物的生理狀態(tài)。酶解溫度除了要考慮酶的最適溫度外，還要考慮原生體再生率。本試驗最適酶解溫度為30℃。

3.5 穩(wěn)定劑的選擇

絲狀真菌原生質(zhì)體再生率較低，可能是因為有原生質(zhì)體缺少細(xì)胞核或其它重要的細(xì)胞器[8]。另外，滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體的再生率有重要的影響。由于僅有細(xì)胞質(zhì)膜的原生質(zhì)體對滲透壓很敏感，很容易破裂，致使原生質(zhì)體外流而使細(xì)胞死亡，這必需在再生培養(yǎng)基中加入滲透壓穩(wěn)定劑[9-10]。滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護原生質(zhì)體免于膨脹作用，還有助于酶和底物的結(jié)合，本試驗用0.6 mol·L-1蔗糖作再生培養(yǎng)基的穩(wěn)滲劑，這與傅力等的研究結(jié)果一致[8]。

4 結(jié)論

微生物能否較好地形成原生質(zhì)體與微生物的生理狀態(tài)和酶的作用狀態(tài)等有一定的關(guān)系[11]，其中酶的作用受菌齡、酶種類及濃度、酶解時間、酶解溫度以及滲透壓穩(wěn)定劑的影響[12]。本研究對影響里氏木霉原生質(zhì)體產(chǎn)生的條件進(jìn)行研究，通過試驗得到里氏木霉40359原生質(zhì)體制備的最佳條件是：采用2%纖維素酶和2%蝸牛酶混合液，菌齡為12 h，酶解溫度30℃，酶解時間2 h，用0.6 mol·L-1蔗糖作再生培養(yǎng)基的穩(wěn)滲劑，原生質(zhì)體的形成數(shù)為6.14×105個·mL-1，原生質(zhì)體再生率為10.6%。

[1]王景林.高活力纖維素酶菌株康氏木霉B-7的選育與產(chǎn)酶條件的研究[J].生物技術(shù),1996,6(6):14-17.

[2]王義甫.高活性纖維素酶菌株778-1的篩選鑒定與產(chǎn)酶條件的研究[J].微生物學(xué)報,1983,23(2):143-149.

[3]韓黎,陳世平,索繼紅.微小根毛霉致病株的原生質(zhì)體形成條件[J].微生物學(xué)通報,1998,25(1):27-29.

[4]曾大興,梁宗琦.哈棲木霉和球孢白僵菌原生質(zhì)體的形成與再生[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,1995,8(1):80-85.

[5]艾云燦,趙學(xué)慧,汪履綏.黑曲霉和里氏木霉原生質(zhì)體形成與再生條件選擇[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1994,13(1):55-58.

[6]崢嶸,張功.綠色木霉原生質(zhì)體的制備與再生研究[J].內(nèi)蒙古師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)(漢文)版,2002,31(2):145-149.

[7]徐敬友.禾谷鐮孢原生質(zhì)體的形成與再生[J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報,1997,18(2):71-73.

[8]傅力,丁友日,王得培,等.里氏木霉DWC原生質(zhì)體制備條件的研究[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2003,26(2):52-55.

[9]曹玉桃,彭化賢,文成敬，等.木霉生防菌T25與T55原生質(zhì)體形成與再生條件的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2007,20(5):997-1001.

[10]章運,傅力.滬釀3042米曲霉原生質(zhì)體制備條件的研究[J].石河子大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2004,22(6)：519-521.

[11]王敬國,張衛(wèi)國,夏林,等.黑曲霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率影響因子研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,38(4):511-514.

[12]李楠,許修宏.黑木耳原生質(zhì)體制備及再生的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,40(7):34-37.