呂俊廷 (綜述), 楊志剛(審校)

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科,廣東醫(yī)學(xué)院檢驗學(xué)院, 廣東 湛江 524001)

自從 1994年 Lapidot等[1]首次報道了具有 CD34+/CD38-表型的人急性髓性白血病干細(xì)胞(leukem ia stem cells,LSC)以來,人們對 LSC的研究不斷深入。LSC是指白血病細(xì)胞中存在的一種類似正常造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSC)的但數(shù)量較少且具有自我更新能力,分化潛能的細(xì)胞。是白血病的發(fā)生發(fā)展、耐藥、復(fù)發(fā)及預(yù)后的影響因素之一。本文將其研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 LSC的來源

對于 LSC的來源,尚沒有明確的結(jié)論。目前存在四種觀點(diǎn)：①來源于 HSC;②來源于部分分化的造血祖細(xì)胞;③來源于血液血管干細(xì)胞和 GMP(granulocyte macrophage precursors)細(xì)胞;④來源于相對成熟的白血病細(xì)胞。

第一種觀點(diǎn)是在比較 LSC與 HSC的生物學(xué)特點(diǎn)提出來的。LSC與 HSC都具有自我更新和分裂增殖能力;具有多種相同的細(xì)胞表面標(biāo)志性分子和多條相同的自我更新調(diào)節(jié)通路。另外,在細(xì)胞端粒酶的活躍表達(dá)、抗凋亡調(diào)控通路的活化、膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的升高,以及遷徙與轉(zhuǎn)移的能力上,兩者都有著明顯的相似性。有實驗證實,干細(xì)胞與腫廇干細(xì)胞在一定的條件下還可以相互轉(zhuǎn)化,如胚胎植入體內(nèi)可以誘導(dǎo)成畸胎瘤,而畸胎瘤細(xì)胞注入鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)可以形成正常胚胎[2]。

第二種觀點(diǎn)的依據(jù)主要來自對白血病不同發(fā)展階段細(xì)胞特征的研究。這些研究表明,早期突變可能發(fā)生在造血干細(xì)胞上,最終的轉(zhuǎn)化事件改變了造血干細(xì)胞或下游祖細(xì)胞表型[3]。這里有兩種可能,一是定向祖細(xì)胞通過累積額外突變獲得干細(xì)胞樣的自我更新能力,二是正常造血干細(xì)胞通過累積基因組和(或)基因的表觀遺傳變化,例如丟失了凋亡能力,最終導(dǎo)致其分化到定向細(xì)胞階段又獲得自我更新能力。Levis等[4]研究表明,由 t(15;17)平衡易位導(dǎo)致的 M3的致病融合基因 PML-RARα(維 A酸受體 a),僅出現(xiàn)在 CD34-/CD38+的細(xì)胞中,不出現(xiàn)在 CD34+/CD38-的干細(xì)胞中,說明白血病的轉(zhuǎn)化事件發(fā)生在干細(xì)胞的以后階段 -祖細(xì)胞,甚至是成熟細(xì)胞。另外,已經(jīng)有研究認(rèn)為急性白血病來源于粒巨祖細(xì)胞(granulocyte-macrophage progenitors),其和造血干細(xì)胞一樣的自我更新能力是獲得性的[5]。Cozzio等[6]用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)純化HSC、CMP(commonmyeloid progenitors)和 GMP(granulocytemacrophage progenitors),使它們帶有白血病融合基因 MLL-ENL,3種細(xì)胞均在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出急性髓系白血病(acutemyeloid leukemia,AML)模型,第 1次用實驗直接證明了LSC可來自于分化了的祖細(xì)胞。

第三種觀點(diǎn)來自于對慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的研究。BCR-ABL融合基因為 CML的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志。Gunsilius等[7]在 CML患者內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有BCR-ABL融合基因存在,CML干細(xì)胞源于 CML患者骨髓中的血液血管干細(xì)胞群體,表達(dá) BCR-ABL融合基因。在單細(xì)胞水平上證實該細(xì)胞群體有成血管內(nèi)皮細(xì)胞和造血的潛能,且可在健康小鼠體內(nèi)復(fù)制出CML。CML干細(xì)胞群體的分離確認(rèn)證實 CML的基因轉(zhuǎn)化發(fā)生在較 HSC更為原始的血液血管干細(xì)胞水平上。Jamie-son等[8]發(fā)現(xiàn)多數(shù)慢粒病人在加速期時體內(nèi) GMP(granulocytemacrophage precursors)細(xì)胞內(nèi) βcatenin的核定位增加,在急變期更是顯著,而 β-catenin與自我更新能力相關(guān),這意味著慢粒急變的本質(zhì)是在 GMP細(xì)胞水平獲得自我更新能力轉(zhuǎn)化成了 LSC。

第四種觀點(diǎn)認(rèn)為相對成熟的白血病細(xì)胞可以通過逆向分化重新獲得 LSC的性質(zhì)。Tsuji-Takayama等[9]用 5-氮雜胞嘧啶核苷(5-azacytidine,5-AzaC)使小鼠胚胎細(xì)胞已分化細(xì)胞逆分化成具有細(xì)胞 -細(xì)胞間界限不太明顯的干細(xì)胞樣形態(tài)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞,而且這些逆轉(zhuǎn)細(xì)胞獲得部分干細(xì)胞標(biāo)志物陽性表型。von Melchner等[10]用在全反式維甲酸存在的人胎盤條件培養(yǎng)基(半固體培養(yǎng)基)上連續(xù)傳代,使人前髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞(HL-60)逆轉(zhuǎn)為重新獲得增殖潛能而末端分化(HL-60原來可還原四唑硝基藍(lán) NBT的活性)特征消失的細(xì)胞,這些實驗都證明了腫瘤細(xì)胞在一定條件下可逆轉(zhuǎn)為腫瘤干細(xì)胞或腫廇干細(xì)胞樣細(xì)胞。

2 LSC免疫表型

免疫表型是細(xì)胞功能和身份的標(biāo)志。LSC具有干細(xì)胞的特性,也具有與 HSC相似的免疫表型。目前的研究熱點(diǎn)是尋找 LSC的特殊表型,從而將其同 HSC區(qū)別開來,進(jìn)行針對于 LSC的特異性治療。1994年,Lapidot等[1]報道了具有 CD34+/CD38-表型的人急性髓性白血病干細(xì)胞,這是人類惡性腫瘤干細(xì)胞的道次報道。1997年、2000年 Blair等[11,12]報道了具有CD34+/Thy-1(CD90)-和CD34+/c-kit(CD117)-的人急性髓性白血病干細(xì)胞,2002年 Peled等[13]報道了具有 Ph+/CD34+/CXCR4+表型的慢性髓細(xì)胞白血病干細(xì)胞,2005年 Feller等[14]報道了 CD133 and/or CD34的人急性髓性白血病干細(xì)胞。2006年Deshpande等[15]通過融合基因 CALM-AF10衍生的AML小鼠模型發(fā)現(xiàn)了 LSC和 HSC的差異,在這個模型中,LSC并不表達(dá)髓系抗原而表達(dá)淋巴系的特殊標(biāo)記 -B220。而且在 CALM-AF10衍生的人 AML中也發(fā)現(xiàn)了 B220+群體。2007年 Hosen等[16]研究發(fā)現(xiàn),CD96可能是急性髓性白血病干細(xì)胞的一個獨(dú)特的表型標(biāo)志。Jordan等[17]報告了 AML患者 LSC表達(dá)CD123,而正常 HSC不表達(dá),van Rhenen等[18]發(fā)現(xiàn)CLL-1在 CD34+CD38-的 LSC上有較高表達(dá),在正常 CD34+CD38-的 HSC上卻沒有表達(dá)。對 CD34+的 AML患者,CLL-1是惡性 CD34+CD38-干細(xì)胞的一個標(biāo)記,其表達(dá)水平在初診和復(fù)發(fā)時無顯著差異。Cox等[19]用原代培養(yǎng)的人類急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),只有具有 CD34+/CD19-或 CD34+/CD20-細(xì)胞表面標(biāo)志的亞群細(xì)胞在移植入 NOD/SCID小鼠后才能引發(fā)人類急性淋巴細(xì)胞白血病,即在人類急性淋巴細(xì)胞白血病中存在有少量以 CD34+/CD19-或 CD34+/CD20-為特異細(xì)胞表面標(biāo)志的腫瘤干細(xì)胞。Jin等[20]用活化的抗 CD44的單克隆抗體Mab(H90)在對正常的組織沒有影響的情況下,可以消除 NOD/SCID小鼠體內(nèi) AML LSC。CD44+可否作為 LSC的一個表面標(biāo)記,還有待于進(jìn)一步研究。

目前較公認(rèn)的急性髓系白血病(M3除外)干細(xì)胞的免疫標(biāo)志為 CD34+CD38-CD71-HLA-DRCD90-CD117-CD123+。至于其它類型的白血病干細(xì)胞表面標(biāo)志,還需更多實驗來支持,但 CD34+/CD38-是 LSC表面標(biāo)志的金標(biāo)準(zhǔn)。

3 LSC的調(diào)控機(jī)制

目前有關(guān) LSC的分子調(diào)控機(jī)制報告較多,歸納起來主要包括磷酸肌酸激酶 3(PI3K)、細(xì)胞膜酪氨酸激酶 -3(FLT3)、Bm i-1基因、MLL基因 、Notch家族基因 、HOX家族基因 、p53 、GATA-1、STAT-5等,對這些調(diào)控分子的研究有助于我們更深刻了解 LSC的特性,有助于發(fā)現(xiàn)白血病新的治療措施。

4 LSC的耐藥機(jī)制

LSC的耐藥機(jī)制止前還沒完全闡明,但可能與LSC的幾個固有特征有關(guān)：①LSC通常處于相對靜止或休眠狀態(tài),而當(dāng)前的抗腫瘤藥主要是靶向迅速增生的分裂期細(xì)胞,因此 LSC不受影響。Guzman等[21]的研究表明,平均高達(dá) 96%的 LSC處于 G0期。處于這一時期的細(xì)胞對常用的化療藥物不敏感,這也使得LSC能夠避開傳統(tǒng)的細(xì)胞周期性化療藥物的攻擊,AML患者經(jīng)化療緩解后,未被清除的 LSC還能繼續(xù)維持疾病,最終造成絕大多數(shù)患者仍會復(fù)發(fā)。②LSC表面表達(dá)多種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,能夠?qū)?Hoechst 33342等熒光染料以及多種化療藥物排出細(xì)胞外,其中 ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮了重要的藥物外排作用。以往的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞上的ABC(ATP結(jié)合盒)轉(zhuǎn)運(yùn)器可以在癌細(xì)胞中過度表達(dá),并將已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的多種抗癌藥物又“泵”出癌細(xì)胞,從而誘發(fā)癌細(xì)胞的多藥耐藥性,降低抗癌化療藥物的臨床療效。對此,臨床上常利用耐藥逆轉(zhuǎn)劑來應(yīng)對,但最近 Raaijmakers等[22]的研究發(fā)現(xiàn),常用的耐藥逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米和環(huán)孢菌素 D衍生物PSC833,只能優(yōu)先阻止抗癌藥物米托蒽醌從正常 HSC中泵出,卻無法有效抑制米托蒽醌從 LSC中排出,這也對白血病的治療方法提出了一個新的問題。③高效的 DNA修復(fù)機(jī)制和凋亡信號的抵制等。

本組篩查對象中發(fā)現(xiàn)實性結(jié)節(jié)的處理采用Fleischner學(xué)會處理指南[4]，初始發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)直徑在6mm以上的，需要把結(jié)節(jié)的大小、形態(tài)、密度及所處肺葉的位置在記錄表上詳細(xì)填寫，而對于初始發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)在6mm以下的，如果結(jié)節(jié)出現(xiàn)分葉、短毛刺、胸膜凹陷等危險因素的也需要提高警惕，應(yīng)建議1～3月內(nèi)再次給予低劑量CT掃描復(fù)查，觀察結(jié)節(jié)的形態(tài)、大小及密度情況，如果此類結(jié)節(jié)同時存在分葉、短毛刺及胸膜凹陷等多種危險因素的[5]，應(yīng)建議活檢或直接手術(shù)切除。

5 LSC理論的臨床價值

目前 LSC理論認(rèn)為,化療可以殺死白血病腫廇細(xì)胞,但殺滅不了白血病干細(xì)胞,腫瘤干細(xì)胞的存在是白血病容易復(fù)發(fā)及耐藥的原因之一,白血病干細(xì)胞的多少也是影響白血病患者預(yù)后因素之一。白血病腫廇細(xì)胞在特定條件下可逆轉(zhuǎn)為白血病干細(xì)胞,逃避化療藥物的傷害,這是白血病復(fù)發(fā)、耐藥及預(yù)后不良的原因之一。因此,對 LSC的深入研究,將為白血病的早期診斷及治療提供新的思路和策略。

5.1 LSC在白血病的早期診斷：目前臨床明確診斷AML的條件是要求形態(tài)異常的 AML細(xì)胞達(dá)到 30%以上,這從病程上講已經(jīng)不是早期診斷,如果能利用抗體選擇方法識別出更特異的 AML LSC表面抗原,則能在AML形態(tài)學(xué)特點(diǎn)尚未出現(xiàn)之前,即發(fā)病初期的分子水平上明確 LSC的分子遺傳學(xué)標(biāo)記,實現(xiàn) AML更早期的診斷。

5.2 LSC在白血病的預(yù)后判斷：LSC存在是白血病復(fù)發(fā)的因素之一,在白血病治療過程中追蹤檢查 LSC的變化,聯(lián)合微小殘留病(MRD)的檢測技術(shù),可以更好地判斷白血病患者的預(yù)后。

5.3 LSC在白血病治療上的研究：導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)與耐藥的根源是 LSC的存在,只有選擇性地徹底殺死LSC才有望徹底治愈白血病,就目前研究所知,可以有以下幾種思路和策略。

5.3.1 根據(jù) LSC表面特異性分子標(biāo)記的不同,或其表達(dá)的蛋白質(zhì)差異,對其實施靶向殺滅。對于白血病而言,靶向抗原可選擇 CD123(IL-3R)分子,其表達(dá)于 LSC而非正常 HSC的特性很適合作為靶向治療的目標(biāo)。大多數(shù) AML母細(xì)胞表面表達(dá) IL-3R。Feuring-Buske等[23]分別用體外培養(yǎng)和移植至 NOD/SCID小鼠體內(nèi)形式證明了白喉毒素 -IL-3融合蛋白(DT388IL3)對白血病母細(xì)胞和 LSC群有毒性作用,而對正常前體細(xì)胞無毒性。在化療前或化療中同時應(yīng)用ABCG2抑制劑或抗 ABCG2抗體,可增加 LSC對化療藥物的敏感性,能有效幫助清除 LSC?，F(xiàn)已應(yīng)用于臨床的吉姆單抗(gemtuzumab)/奧佐米星(ozogamicin)是人源化的抗 CD33單抗和細(xì)胞毒抗腫瘤抗生素刺孢霉素(calicheamicin)的偶聯(lián)物,用于治療復(fù)發(fā)的 AML,并取得了顯著療效。最近的發(fā)現(xiàn)抗 CD44的單抗可以消除 AML干細(xì)胞[20]。

5.3.2 干擾白血病微環(huán)境：LSC需要與其微環(huán)境相互作用才可支持其干細(xì)胞特征,如果 LSC細(xì)胞不能夠到達(dá)微環(huán)境便不能繼續(xù)繁殖。最近研究發(fā)現(xiàn)黏附分子CD44可以介導(dǎo) LSC在骨髓和脾中歸巢,利用一個可以直接黏附在 CD44上的單克隆抗體 H90,可顯著減少人類 AML細(xì)胞移植到 SCID小鼠身上的能力。

5.3.3 誘導(dǎo) LSC的特異免疫：異基因供體細(xì)胞介導(dǎo)的繼發(fā)移植物抗白血病效應(yīng),在有些患者可能以 LSC為靶向。Bonnet等[24]報道了用細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞(CTL)克隆特異性針對次要組織相容性抗原,抑制人AML細(xì)胞在 NOD-SCID小鼠體內(nèi)的植入,并證實了該抑制作用由 CTL直接針對 LSC介導(dǎo)。該研究表明適當(dāng)?shù)囊浦参镎{(diào)控及正確鑒定和選擇 T淋巴細(xì)胞克隆,能有效引發(fā)抗 LSC免疫反應(yīng),防治異基因干細(xì)胞移植后的白血病再復(fù)發(fā)。

5.3.4 促進(jìn)分化：通過誘導(dǎo) LSC分化為成熟細(xì)胞,從而失去自我更新能力。目前腫瘤分化誘導(dǎo)治療在維甲酸治療急性早幼粒細(xì)胞白血病中取得顯著療效。臨床上診斷為急性早幼粒細(xì)胞白血病的病人,使用全反式維甲酸誘導(dǎo) LSC分化,同時結(jié)合化療藥治療后,約有90%的病人獲得完全緩解,70%的病人治愈。

5.3.5 誘導(dǎo)凋亡：針對腫瘤特異的癌蛋白進(jìn)行靶向治療可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化成熟,然后象正常細(xì)胞一樣凋亡。全反式維甲酸(RA)治療 AML和伊馬替尼(Imatinib)治療費(fèi)城染色體(Bcr-Abl)陽性的慢性骨髓性白血病(CML)是誘導(dǎo)分化治療腫瘤中兩個成功的例子。Fujisaki等[25]發(fā)現(xiàn) bestain,一種氨基肽酶抑制劑,能選擇性殺傷 ph+的 CML干細(xì)胞并且能刺激正常造血?？赡艿臋C(jī)制是 CML的 CD34+細(xì)胞上 fas受體表達(dá)增加,抗 fas受體的 IgM能誘導(dǎo)其凋亡,而bestain就是協(xié)同抗 fas受體的 IgM、TNFα、IFNγ等物質(zhì)誘導(dǎo)慢粒干細(xì)胞凋亡的。

5.3.6 針對 LSC的特殊分子調(diào)控機(jī)制的靶向治療：FLT3的抑制劑、核因子 NF-κB的蛋白酶抑制劑(MG-132)、PI3K抑制劑等都可以通過其分子調(diào)控途徑作用于 LSC,而對正常的 HSC影響甚少。

5.3.7 多靶點(diǎn)聯(lián)合治療：通過 NF-κB及 PI3K介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路調(diào)控 LSC生存,以 p53介導(dǎo)的凋亡信號通路調(diào)控 LSC死亡,將阻斷生存信號與激活死亡信號聯(lián)用,能更好的靶向 LSC。

5.3.8 抑制運(yùn)載體的作用：ABC運(yùn)載體的高表達(dá)使得常規(guī)細(xì)胞毒藥物不能對 LSC發(fā)揮應(yīng)有的作用,從而增加了對 LSC靶向殺傷的難度。通過有效抑制運(yùn)載體也許可以使藥物進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)對 LSC產(chǎn)生殺傷作用。

5.3.9 削弱增殖能力：Phatak等人使用小分子藥物RHPS4選擇性抑制白血病干細(xì)胞的端粒酶催化亞基(hTERC)的活性,結(jié)果造成白血病干細(xì)胞增殖能力明顯下降。

5.3.10 未明的機(jī)制：Guzman等 研究發(fā)現(xiàn),TDZD-8(4-benzyl,2-methyl,1,2,4-thiadiazo-lidine,3,5-dione)可能通過抑制 PKC和 FLT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑釋放游離的巰基化合物,快速破壞白血病干細(xì)胞的完整性,在 2h內(nèi)殺死白血病干細(xì)胞,而正常的干細(xì)胞則不受影響。但其靶向殺傷的機(jī)制還有待研究。[26]

隨著 LSC研究的不斷深入,使我們從一個全新的角度認(rèn)識了白血病的發(fā)生發(fā)展,為白血病發(fā)病的分子機(jī)制研究、疾病監(jiān)控、治療策略以及預(yù)后判斷提供理論依據(jù)。下一步的研究目標(biāo)是進(jìn)一步了解 LSC的特性,尤其是 LSC的起源,尋找 LSC與HSC之間的根本差異性,為特異性地消除 LSC,并最大程度地減少對正常HSC的影響提供理論基礎(chǔ)。為徹底治愈白血病找到最有效的途徑。

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