王紹輝，崔志峰

(浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江杭州310032)

α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)影響因素的研究進展

王紹輝，崔志峰*

(浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江杭州310032)

α-淀粉酶作為一種重要的工業(yè)酶制劑，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛。對近年來報道的有關(guān)溫度、pH、碳氮源、金屬離子、微量元素、溶氧、發(fā)酵工藝等影響α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)的各種因素進行了綜述，旨在為指導(dǎo)α-淀粉酶的工業(yè)生產(chǎn)和進一步提高生產(chǎn)效率提供參考。

α-淀粉酶，碳氮源，金屬離子，微量元素，發(fā)酵工藝

1 培養(yǎng)基成分對發(fā)酵生產(chǎn)的影響

1.1 碳氮源對發(fā)酵生產(chǎn)的影響

在α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)中常用的碳源為可溶性淀粉或生淀粉，常用的氮源有酵母提取物、大豆粉、肉汁提取物、蛋白胨等。但是，從工業(yè)能耗和生產(chǎn)成本考慮，越來越多的生產(chǎn)廠家開始用一些低成本又能提供良好碳氮源的農(nóng)業(yè)廢料如麩皮、油餅來替代成本較高的可溶性淀粉、酵母膏和蛋白胨等精細碳氮源。盡管麩皮等殘料在顆粒大小、碳氮比例上參差不齊，同時這類殘料含有一些未知的雜質(zhì)，然而這些替代品不但能提供豐富的營養(yǎng)，而且成本十分低廉，經(jīng)過研究和優(yōu)化可以成為良好的碳氮源。

利用低成本的農(nóng)業(yè)原料將是以后大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的趨勢。Saban［5］等研究 Bacillus amyloliquefaciens NRRL-645利用蓖麻油餅發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶時，用響應(yīng)面法對固體發(fā)酵過程中蓖麻油餅、蛋白胨、酵母提取物和(NH4)2SO4進行了優(yōu)化，當蓖麻油餅、蛋白胨、酵母提取物、(NH4)2SO4的含量分別為22.62、5.20、1.62、6.81g/L時，α-淀粉酶產(chǎn)量可達到最高為4895U;而在實際培養(yǎng)中產(chǎn)量達到了4827U，與優(yōu)化前相比提高了8%。

Rajagopalan［6］等以農(nóng)業(yè)廢料作為碳氮源，利用一株枯草芽孢桿菌KCC103進行α-淀粉酶的深層液體發(fā)酵生產(chǎn)。實驗首先對一系列可以作為碳源的麥麩、甘蔗渣、米糠和麥桿等農(nóng)業(yè)廢料作了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)利用麥麩生產(chǎn)α-淀粉酶產(chǎn)量最高，這與麥麩含有大量的碳水化合物和蛋白質(zhì)有關(guān)。實驗還對適合作為氮源的太陽花油餅、蓖麻油餅、棉籽油餅、芝麻油餅和花生油餅進行了分析，其中太陽花油餅最適合枯草芽孢桿菌KCC103進行α-淀粉酶生產(chǎn)。實驗將麥麩和太陽花油餅以1∶1進行混合發(fā)酵得到了較高的α-淀粉酶產(chǎn)量(90U/mL)。根據(jù)響應(yīng)面法對培養(yǎng)基進行優(yōu)化后產(chǎn)量進一步提高，當將麥麩和太陽花油餅以1.27%和1.42%進行混合發(fā)酵時，產(chǎn)量比原來提高了14倍，達到1258U/mL。

在固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶時，麩皮作為廉價的農(nóng)業(yè)加工產(chǎn)品的廢棄物是十分常用的替代碳源。劉仲敏［7］等在研究米曲霉ZLF13固態(tài)發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)麩皮中淀粉的含量會影響到最終α-淀粉酶的產(chǎn)量。在培養(yǎng)基滅菌后，淀粉含量少的麩皮不易粘成團，有利于通氣，但是碳氮比較低;而淀粉含量過高的麩皮滅菌后易粘成團，影響通氣性，而且粘團內(nèi)部的淀粉也不利于菌絲的利用吸收。通過實驗發(fā)現(xiàn)，出粉率在60%左右的麩皮最適合用于米曲霉ZLF13生產(chǎn)α-淀粉酶，在這種生產(chǎn)條件下得到的α-淀粉酶的酶活最高，在中試中平均酶活可達到1283U/g。

1.2 金屬離子和其他無機離子對發(fā)酵生產(chǎn)的影響

α-淀粉酶是一種金屬酶，在發(fā)酵過程中適當?shù)丶尤胍恍┙饘匐x子對于α-淀粉酶的產(chǎn)量有一定的促進作用。Gupta等曾對一些金屬離子的影響作過綜述，常見的金屬離子如K+、Fe2+、Mo2+、Cl-等對于α-淀粉酶的產(chǎn)量基本沒有影響;Mg2+則對產(chǎn)量起著關(guān)鍵的作用，在沒有添加Mg2+的情況下產(chǎn)酶量會下降50%;Mn2+對于產(chǎn)量也會有一定的促進作用;而Co2+可以使菌體量大大增加但是會導(dǎo)致產(chǎn)量有一定的下降［8］。Dhanya［9］等用 Box-Behnken理論對Bacillus amyloliquefaciens利用麥麩和花生油餅深層液體發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶進行優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時間和CaCl2濃度對發(fā)酵結(jié)果起決定作用。當培養(yǎng)時間和CaCl2濃度分別為42h和0.0275mol/L時產(chǎn)酶量達到最高。其他無機離子對于α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)也有影響，如Ueno等［10］發(fā)現(xiàn)在利用Aspergillus oryzae生產(chǎn)α-淀粉酶過程中磷酸鹽對于初期的產(chǎn)酶和后續(xù)的次級代謝有十分重要的調(diào)控作用，研究發(fā)現(xiàn)，在磷酸鹽的濃度超過0.2mol/L時菌體數(shù)和酶的產(chǎn)量都有提高，而低于這個濃度時細胞密度和產(chǎn)酶量都有明顯下降，但是在高濃度的磷酸鹽培養(yǎng)基中，產(chǎn)酶量嚴重下降。

1.3 生長因子對發(fā)酵生產(chǎn)的影響

Rajagopalan［11］等在研究利用 Bacillus subtilis KCC103進行發(fā)酵生產(chǎn)時發(fā)現(xiàn)一些微量的生長因子對于產(chǎn)量有著重要的影響。有些氨基酸如組氨酸、纈氨酸、賴氨酸和酪氨酸對酶的產(chǎn)量起阻礙作用，而添加了0.03%的半胱氨酸后，產(chǎn)量增加了2倍。B族維生素添加到培養(yǎng)基后產(chǎn)量也有明顯提高，影響最大的是維生素B1和B6，當添加0.02%的維生素B1后，產(chǎn)量提高2.35倍。一些表面活性劑對產(chǎn)量也有一定的影響，如SDS對產(chǎn)量起促進作用，而其他的表面活性劑如吐溫20、吐溫-80等都對產(chǎn)量起阻礙作用。他們對上述因子進行了優(yōu)化，在3%生土豆、2%酵母提取物、0.03%半胱氨酸、0.02%維生素 B1、0.02%SDS和0.5mmol/L MgSO4培養(yǎng)基中，36～48h后酶活最大為 537.7U/mL。Prakasham［12］等在研究Aspergillums awamori生產(chǎn)酸性α-淀粉酶的影響因素時發(fā)現(xiàn)，除了底物濃度和pH對酶產(chǎn)量的影響外，酪蛋白和MgSO4對于α-淀粉酶產(chǎn)量也有明顯的影響，在0.125%MgSO4和1.5%酪蛋白條件下，酶產(chǎn)量最高。

2 發(fā)酵條件的影響

2.1 溫度的影響

溫度在微生物的生長和代謝過程中起著至關(guān)重要的作用。一般用于工業(yè)生產(chǎn)α-淀粉酶的菌株多為絲狀真菌和芽孢桿菌。多數(shù)生產(chǎn)α-淀粉酶的絲狀真菌最佳生長溫度為25～37℃，一些生產(chǎn)耐高溫α-淀 粉 酶 的 真 菌，如 Talaromycesemersonii、Thermomonspora fusca和 Thermomyces lanuginosus等最適溫度在50～55℃;生產(chǎn)α-淀粉酶的芽孢桿菌，如Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis和Bacillus stearothermophilus的最適生長溫度在37～60℃，一些產(chǎn)超耐熱α-淀粉酶的細菌如Thermococcus profundus和 Thermatoga maritima的最佳生長溫度是 80℃［1］。一株工 程菌 Bacillus licheniformis NH1的最適溫度在37℃［13］，在一些產(chǎn)特殊性質(zhì)α-淀粉酶的細菌中，它們對溫度的要求更加苛刻，如一株產(chǎn)耐冷α-淀粉酶的細菌的最適溫度為4℃［8］。

2.2 pH的影響

pH在生產(chǎn)過程中是十分重要的參數(shù)。而且隨著發(fā)酵的進行，一些代謝物的釋放會改變最初的生長pH，這種變化同時也會對產(chǎn)物的穩(wěn)定性造成一定影響。通常真菌喜歡偏酸性的生產(chǎn)環(huán)境，而細菌在中性環(huán)境下生長較好。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)一些曲霉屬的真菌如 Asperjillus oryzae、Asperjillus ficuum、和 Asperjillus niger在液體深層發(fā)酵過程中，當 pH在5.0～6.0時α-淀粉酶產(chǎn)量最高［14-16］。而細菌如Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis和 Bacillus stearothermophilus需要的起始pH為7.0［1］。一些產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的細菌則需要在一個相對偏酸性的環(huán)境下才能達到最大產(chǎn)量，如Thermococcus profundus在pH4.5時產(chǎn)酶量最高［17］。Prakasham［12］等在研究Aspergillums awamori生產(chǎn)酸性α-淀粉酶的影響因素時發(fā)現(xiàn)，pH4.0時酶產(chǎn)量最高。

2.3 溶氧的影響

在一些耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)菌株在對數(shù)期時強烈需氧，這一時期的供氧量成為菌體生長的限制性因子，對于后來的產(chǎn)酶量有直接影響。林劍［18］等通過對一株α-淀粉酶生產(chǎn)菌株IIY-1液體發(fā)酵的研究發(fā)現(xiàn)，在對數(shù)期需要大量的溶氧，過了對數(shù)期后對氧氣的需求仍較大，保證對數(shù)期后的產(chǎn)酶階段溶氧不低于10%對于該菌株的耐高溫α-淀粉酶發(fā)酵順利進行仍然是很重要的。在固態(tài)發(fā)酵中，Rahardjo等通過研究A.oryzae CBS570.64在低溶氧情況下的生長狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，當溶氧在1%時，菌絲生長緩慢，當降至0.25%時，菌絲的生長明顯受限，同時發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量嚴重下降;當溶氧升至21%時，菌絲生長迅速且發(fā)酵產(chǎn)物量也大大增加［19］。

3 結(jié)論與展望

α-淀粉酶在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛。隨著人類對工業(yè)能耗的關(guān)注和重視，采用低廉的生物加工廢料和高效的加工工藝將是今后生產(chǎn)α-淀粉酶的首選方法。但是，α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)的影響因素很多，尤其是利用低廉的生物加工廢料進行生產(chǎn)時影響因素更加復(fù)雜。除此之外，接種方式、生產(chǎn)工藝流程等也會對產(chǎn)量有很大影響。尹源明等［20］通過添加氧載體正十二烷提高發(fā)酵體系的氧氣傳遞速率從而促進了發(fā)酵體系的產(chǎn)酶能力。在批量生產(chǎn)過程中接種的方式對結(jié)果也有很大的影響，Tari和Milner［21］等研究發(fā)現(xiàn)兩步接種法比一步法的產(chǎn)酶量要高。細胞的固定化技術(shù)也被應(yīng)用于α-淀粉酶的生產(chǎn)過程中，Konsoula［22］等將2%海藻酸鈣和3.5%CaCl2用于包埋地衣芽孢桿菌進行α-淀粉酶的固定化生產(chǎn)，使產(chǎn)酶量提高了176%。因此，α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)的影響因素與酶產(chǎn)量之間有直接關(guān)系。對α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)的影響因素進行研究和優(yōu)化，有利于進一步降低α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，促進α-淀粉酶發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展。

［1］Sivaramakrishnan S，Gangadharan D，Nampoothirik M，et al. α-Amylase from microbial sources-An overview on recent developments［J］.Food Technology and Biotechnology，2006，44 (2):173-183.

［2］Pandey A，Nigam P，Soccol C，et al.Advances in microbial amylase［J］.Biotechnology and Applied Biochemistry，2000，31: 135-152.

［3］Marc C，Maarel V，Veen B，et al.Properties and applications of starch-converting enzyme of the α-amylase family［J］.Journal of Biotechnology，2002，94:137-155.

［4］Reddy N，Nimmagadda A，Rao K，et al.An overview of the microbialα-amylase family［J］.African Journal of Biothchnology，2003(2):645-648.

［5］Saban M，Selen V，Ozer D，et al.Optimization of α-amylase production in solid substrate fermentation［J］.The Candian Journal of Chemical Engineering，2009，87:493-498.

［6］Rajagopalan G，Krishnan C.Optimization of agro-residual medium for α-amylase production from a hyper-producing Bacillus subtilis KCC103 in submerged fermentation［J］.Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2008，84:618-625.

［7］劉仲敏，郭士軍，薛永梅.真菌α-淀粉酶固態(tài)發(fā)酵工藝及酶學性質(zhì)研究［J］.河南科學，2008，26(2):176-180.

［8］Gupta R，Gigras P，Mohapatra H，et al.Microbialα-amylase:a biotechnological perspective［J］.Process Biochemistry，2003，38: 1599-1616.

［9］Gangadharan D，Sivaram S，Nampthiri K，et al.Response surface methodology forthe optimization ofalphaamylase production by Bacillusamyloliquefaciens［J］.Bioresource Technology，2008(5):4597-4602.

［10］Ueno S，Miyama M，Ohashi Y，et al.Secretory enzyme production and condition of Aspergillus oryzae in submerged liquid culture［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1987，26: 273-276.

［11］Rajagopalan G，Krishnan C.Optimization of medium and process parameters for a constitutive α-amylase production from a catabolite derepressed Bacillus subtilis KCC103［J］.Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2008，83:654-661.

［12］Prakasham R，Rao S，Rao R，et al.Enhancement of acid amylase production by an isolated Aspergillus awamori［J］. Journal of Applied Microbiology，2007，102:204-211.

［13］Hmidet N，Bayoudh A，Berrin J，et al.Purification and biochemical characterization of a novel α-amylase from Bacillus licheniformis NH1 Cloning，nucleotide sequence and expression of amyN gene in Escherichia coli［J］.Process Biochemistry，2008，43:499-510.

［14］Morkeberg R，Carlsen M，Neilsen J，et al.Induction and repression of α-amylase production in batch and continuous cultures of Aspergillus oryzae［J］.Microbiology，1995，141: 2449-2454.

［15］Agger T，Spohr A，Carlsen M，et al.Growth and product formation of Aspergillus oryzae during submerged cultivations［J］. Biotechnology Bioengineering，1998，57:321-329.

［16］Hernandez M，Rodriguez M，Rodriguez R，et al.Amylase production by Aspergullus niger in submerged cultivation on two wastes from food industries［J］.Journal of Food Engineering，2006，73:93-100.

［17］Horvathova V，Godany A，Sturdikf E，et al.α-Amylase from Thermococcus hydrothermalis Recloning aimed at the improved expression and hydrolysis of corn starch［J］.Enzyme and Microbiol Technology，2006，39:1300-1305.

［18］林劍，鄭舒文，郭盡力.溶氧等參數(shù)對耐高溫α-淀粉酶發(fā)酵的影響［J］.食品科學，2002，23(3):54-57.

［19］Rahardjo Y，Sie S，Weber F，et al.Effect of low oxygen concentration on growth andα-Amylase production of Aspergillus oryzae in model solid-stage fermentation systems［J］. Biomolecular Engineering，2005，21:163-172.

［20］尹源明，鄭曉冬，何國慶.氧載體對α-淀粉酶發(fā)酵過程影響的研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2000，16(4):141-145.

［21］Tari C，Parulekar SJ，Stark BC，et al.Synthesis and excretion of alpha-amylase in vgb(+)and vgb(-)recombinant Escherichia coli:A comparative study［J］.Biotechnology and Bioengineering，1998，9:673-678.

［22］Konsoula Z，Liakopoulou M.Thermostable α-Amylase production by Bacullus subtilis entrapped in calcium alginate gel capsules［J］.Enzyme and Microbial Technology，2006，39:690 -696.

Research progress in influencing factors of fermentation conditions of α-amylase

WANG Shao-hui，CUI Zhi-feng*
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China)

α-amylase has a broad spectrum of industrial applications as an industrial enzyme.In this review，factors that influence fermentation of α-amylase including temperature，pH，mental ions，trace elements，nitrogen and carbon sources，concentration of dissolved oxygen and fermentation process were summarized.

α-amylase;carbon and nitrogen sources;mental ions;trace elements;fermentation process

TS201.3

A

1002-0306(2011)03-0456-03

α-淀粉酶的系統(tǒng)命名為α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.1)，是重要的工業(yè)酶制劑，可以隨機切斷直鏈淀粉或支鏈淀粉中相鄰的α-1，4-糖苷鍵、將淀粉水解為糊精和一系列以葡萄糖為組成單位的低聚糖［1］。α-淀粉酶最早在 1811年由Kirchhoff發(fā)現(xiàn)，它廣泛分布于微生物、植物和動物，但淀粉酶生產(chǎn)菌株主要來源于真菌和細菌，如Asperjillus aryzae、Bacillus subtilis、Bacilluss licheniformis等［2］。α-淀粉酶在現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用于酒精釀造、淀粉深加工、焙烤工業(yè)、啤酒釀造、紡織和醫(yī)藥工業(yè)［3-4］。由于利用α-淀粉酶進行工業(yè)生產(chǎn)可以縮短生產(chǎn)周期、提高產(chǎn)品得率和原料利用率、減少能耗，越來越引起人們的關(guān)注。目前，工業(yè)上生產(chǎn)α-淀粉酶主要是通過微生物發(fā)酵的方法，其中可以分為固態(tài)發(fā)酵(SSF)和深層液體發(fā)酵(SmF)。固體發(fā)酵是一種培養(yǎng)基呈固態(tài)、利用自然底物作為碳氮源的發(fā)酵方法，對設(shè)備的要求較低。深層液體發(fā)酵相比于固體發(fā)酵方法有許多優(yōu)點:先進的生產(chǎn)工藝，大大提高了底物的利用率;生產(chǎn)周期短，質(zhì)量穩(wěn)定;機械化生產(chǎn)，提高了勞動生產(chǎn)率。在工業(yè)生產(chǎn)中，發(fā)酵條件對α-淀粉酶產(chǎn)量有重要的影響。本文通過對近年來α-淀粉酶生產(chǎn)中的各種影響因素及優(yōu)化的研究成果進行綜述，旨在為進一步提高α-淀粉酶生產(chǎn)效率提供參考。

2010-02-08 *通訊聯(lián)系人

王紹輝(1985-)，男，碩士研究生，研究方向:生物技術(shù)。