張 佩 芝

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝分院，哈爾濱 150069)

分子標(biāo)記(molecular marker)是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶及等位酶。狹義的分子標(biāo)記指的就是DNA標(biāo)記，而這個(gè)界定現(xiàn)在被廣泛采納。在國家“863計(jì)劃”的支持下，我國科研人員利用分子標(biāo)記技術(shù)掌握了一批大農(nóng)作物重要經(jīng)濟(jì)性狀的改良方法，并應(yīng)用于遺傳育種實(shí)踐中，同時(shí)建立了分子標(biāo)記輔助育種與常規(guī)育種相結(jié)合的技術(shù)體系，提高了定向育種的效率和水平。

在重要的園藝作物黃瓜上，則開展了黃瓜抗病性(霜霉病、炭疽病、白粉病、枯萎病、細(xì)菌性角斑病)、黃瓜全雌性、黃瓜性別分化等重要性狀的分子標(biāo)記技術(shù)研究，構(gòu)建了一批有應(yīng)用價(jià)值的分離群體，獲得了一批重要性狀的分子標(biāo)記或QTL；在國際上首次對(duì)黃瓜性別決定基因進(jìn)行定位，構(gòu)建了黃瓜歐亞生態(tài)型間的飽和永久分子圖譜。利用黃瓜白粉病分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)育種材料進(jìn)行抗性鑒定和篩選，選出抗白粉病單株40余個(gè)。由于分子標(biāo)記技術(shù)在黃瓜育種中的重要地位，本文綜述了分子標(biāo)記技術(shù)在黃瓜育種中的應(yīng)用現(xiàn)狀，以期為今后黃瓜育種提供理論指導(dǎo)。

1 分子標(biāo)記遺傳圖譜的建立

分子標(biāo)記遺傳圖譜是指以遺傳標(biāo)記間重組頻率為基礎(chǔ)的染色體或基因內(nèi)位點(diǎn)的相對(duì)位置的線性排列圖。它可為基因定位與克隆及基因組結(jié)構(gòu)和功能的研究提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。但由于黃瓜的遺傳基礎(chǔ)狹窄，其遺傳圖譜相對(duì)大田作物如水稻、小麥等較為落后，經(jīng)典的遺傳圖譜僅由一百多個(gè)顏色、形態(tài)和抗病性等基因組成6個(gè)連鎖群[1]。

人們通過對(duì)黃瓜的栽培種的雜交與研究，深入地探索黃瓜的遺傳規(guī)律得到豐碩成果：Kennard等[2]利用RFLP、RAPD、同工酶、形態(tài)和抗病性所產(chǎn)生的標(biāo)記，進(jìn)行了黃瓜遺傳圖譜的構(gòu)建，得到58個(gè)位點(diǎn)的遺傳圖譜，分屬10個(gè)連鎖群，該圖譜覆蓋的基因組總長度約為766cm，標(biāo)記間平均距離約為21cm[3]；Danin-Poleg等[4]以GY14×PI183967為材料，用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了黃瓜的遺傳圖譜，將14個(gè)SSR標(biāo)記定位到8個(gè)連鎖組群中，整合圖譜總長為783.2cm，并發(fā)現(xiàn)其中有9個(gè)標(biāo)記與甜瓜相同；張海英等[5]利用黃瓜歐洲溫室生態(tài)型栽培種高代自交系“歐洲八號(hào)”和華北露地生態(tài)型品種“秋棚”雜交獲得的140份重組自交系，構(gòu)建了包含有141個(gè)AFLP標(biāo)記、89個(gè)RAPD標(biāo)記、4個(gè)SSR標(biāo)記等234個(gè)標(biāo)記的連鎖圖譜，由9個(gè)連鎖組群組成，覆蓋整個(gè)基因組727.5cm，平均圖距3.1cm。整合工作的進(jìn)行，使黃瓜遺傳圖譜的密度和覆蓋基因組的長度顯著增加，為基因定位和分子標(biāo)記輔助育種提供了理論依據(jù)[6]。

2 相關(guān)基因的定位

生物的性狀是由基因控制的，想獲得優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)性狀就要尋找與質(zhì)量性狀基因緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記。目前，隨著新的分子標(biāo)記技術(shù)不斷成熟、黃瓜遺傳圖譜的日趨完善，與黃瓜重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因的定位也取得了很大進(jìn)展。發(fā)表的黃瓜各類形態(tài)學(xué)基因已達(dá)到132個(gè)。顧興芳等[7]運(yùn)用AFLP技術(shù)，采用集群分析法(BSA)進(jìn)行與黃瓜果實(shí)苦味基因連鎖的分子標(biāo)記的研究，找到了與苦味基因連鎖的兩個(gè)顯性AFLP標(biāo)記；陳學(xué)好等[8]用65條ISSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選，其中引物N92在親本和DNA池之間擴(kuò)增出一條大小為850bp多態(tài)性片段，經(jīng)F2代群體135個(gè)單株驗(yàn)證，該片段穩(wěn)定出現(xiàn)，在單性結(jié)實(shí)植株中表現(xiàn)為無帶，在非單性結(jié)實(shí)植株中表現(xiàn)為有帶，可以作為鑒別單性結(jié)實(shí)與非單性結(jié)實(shí)的標(biāo)記引物。

3 親緣關(guān)系的分析與種質(zhì)資源多樣性的檢測

分子標(biāo)記能夠有效地進(jìn)行種質(zhì)親緣關(guān)系分析和遺傳多樣性的研究。該技術(shù)在黃瓜上也有這深入的研究和報(bào)道：Dijkhuizen等[9]利用RFLP標(biāo)記評(píng)價(jià)兩組黃瓜種質(zhì)的遺傳多樣性。在第一組16個(gè)品系中，RFLP標(biāo)記反映了與同工酶分析一致的品種間的親緣關(guān)系；第二組35個(gè)栽培品種中，RFLP分析揭示了與形態(tài)及實(shí)際系譜關(guān)系相一致的品種間的親緣關(guān)系，認(rèn)為RFLP可用于黃瓜分類鑒定和品種保護(hù)；Staub等[10]用同工酶和RAPD標(biāo)記評(píng)價(jià)了38個(gè)黃瓜品系的多態(tài)性。顧興芳等使用AFLP技術(shù)對(duì)國內(nèi)外多個(gè)生態(tài)型的15份黃瓜品種進(jìn)行了遺傳親緣關(guān)系分析，所用14個(gè)引物組合有9個(gè)組合得到的譜帶清晰、齊全。陳勁楓等采用SSR和RAPD兩種分子標(biāo)記對(duì)黃瓜屬22份不同類型材料的親緣關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，野黃瓜與黃瓜間的遺傳距離小于其與甜瓜間的距離[11]。

黃瓜的品種分類方法較多，包括地理分布和形態(tài)等不同變種或類型的界定方式。我國的黃瓜育種研究存在育種材料親緣過分單一的問題，育種工作進(jìn)展艱難。因此對(duì)黃瓜各種生態(tài)類型之間的親緣關(guān)系的研究，有助于合理引進(jìn)國外種質(zhì)資源和充分利用野生種質(zhì)資源，有效地進(jìn)行親本選擇選配，提高育種效率。

4 分子標(biāo)記在黃瓜育種中的輔助選擇作用

植物育種中分子標(biāo)記輔助選擇是通過分析與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記來判斷目標(biāo)基因是否存在。對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行正確選擇和有效分離是植物育種的中心環(huán)節(jié)。分子標(biāo)記輔助育種是現(xiàn)代分子生物學(xué)與傳統(tǒng)遺傳育種的結(jié)合，借助分子標(biāo)記對(duì)育種材料從DNA分子水平上進(jìn)行選擇，可以對(duì)與目標(biāo)性狀連鎖的單個(gè)或多個(gè)基因進(jìn)行檢測、定位和跟蹤，并可以檢測是否有不良性狀基因的連鎖，減少了育種選擇的盲目性，從而達(dá)到作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等綜合性狀的高效改良，提高育種效率[3]。

Witkowicz等[12]利用NILs結(jié)合BSA法，找到了與黃瓜性別表現(xiàn)相關(guān)的AFLP標(biāo)記。黃瓜性別分化由3個(gè)主要基因控制：F、M和G，通過基因互作共同決定黃瓜性別；陳勁楓等[13]也利用RAPD結(jié)合BSA法對(duì)黃瓜性別特異基因進(jìn)行了分子標(biāo)記篩選，發(fā)現(xiàn)全雌性單株都含有特異片段B11-1000，并以ACC合酶基因的特異引物檢測分離群體單株，發(fā)現(xiàn)該酶基因不具有性別特異性，這與前人研究結(jié)果不同。黃瓜全雌性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲得，為早期進(jìn)行性別鑒定提供了理論指導(dǎo)。利用分子標(biāo)記的方法在黃瓜育種中起到了巨大的作用，即讓所得品種更快捷地達(dá)到育種目標(biāo)，又準(zhǔn)確地使基因更好的表達(dá)，為育種工作更好更快地完成提供了理論基礎(chǔ)。

5 品種純度鑒定

在植株育種中最大的困難之一就是品種純度的鑒定，常規(guī)的鑒定方法是根據(jù)田間表型性狀進(jìn)行鑒定，后來發(fā)展為利用同工酶的方法，但是兩種方法均存在著不同程度的缺陷?，F(xiàn)在的分子標(biāo)記育種彌補(bǔ)了以上兩種方法的缺點(diǎn)，該方法快速(數(shù)小時(shí)或數(shù)天)、準(zhǔn)確、簡便、成本也不太高，在幼苗或種子階段就可鑒定出品種的純度。

Matsuura等[14]發(fā)現(xiàn)利用RFLP分析可快速檢測黃瓜雜交一代F1品種的純度。孫敏等從102個(gè)RAPD引物中篩選出應(yīng)用于黃瓜種子純度鑒定的引物32條，并建立了應(yīng)用于鑒定親本和雜交種子的RAPD指紋圖譜。Truksa等利用3個(gè)黃瓜親本材料，分析了其RAPD多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性程度較差，認(rèn)為RAPD分析不適于驗(yàn)證黃瓜雜交種純度。

在黃瓜育種上，常規(guī)方法乃至部分改良方法中均不同程度地存在一些缺點(diǎn)，而新興的技術(shù)——分子標(biāo)記育種能夠在某種程度上彌補(bǔ)常規(guī)方法的不足。分子標(biāo)記育種的知識(shí)體系龐大而系統(tǒng)，它是具有特異性和針對(duì)性的，通過今后更加系統(tǒng)深入的研究，該技術(shù)有著廣闊的前景，對(duì)以后的黃瓜種質(zhì)資源創(chuàng)建、管理以及利用必將發(fā)揮更加巨大的作用。

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