郭曉靜綜述 王玉明 段 勇審校

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的腫瘤之一，死亡率居腫瘤死亡率之首，我國肺癌發(fā)病率及死亡率均居腫瘤之首［1］。

與肺癌形成有關(guān)的遺傳學(xué)機(jī)制主要包含2種［2］，其一是DNA分子核苷酸序列的異常改變造成的基因突變即傳統(tǒng)的遺傳學(xué)機(jī)制;另外是表觀遺傳學(xué) (epigenetics)機(jī)制。相比傳統(tǒng)遺傳學(xué)信息表觀遺傳學(xué)可提供更高層次的遺傳學(xué)信息。現(xiàn)就表觀遺傳學(xué)在肺癌中的研究作一綜述。

1 DNA甲基化與肺癌

1.1 DNA甲基化

哺乳動(dòng)物DNA甲基化(DNA methylation)［3］是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyl transferase，DNMT)催化下，由 S－腺苷蛋氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶磷酸鳥嘌呤二核苷酸(CpG)的5＇－末端，形成mCpG的過程。DNA甲基化是真核生物體內(nèi)普遍存在的1種基因內(nèi)源性修飾。富含CpG序列的區(qū)域稱為 CpG 島，長200～1000 bp，常位于5＇－末端，是 DNA 甲基化發(fā)生的高頻區(qū)域，有70%～80%可呈現(xiàn)甲基化。在正常生理情況下，該區(qū)域因胚胎早期的特異性去甲基化而處于非甲基化狀態(tài)。CpG島受到各種有害因素影響時(shí)，容易發(fā)生甲基化，從而導(dǎo)致基因沉默。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，CpG以2種形式存在，一種為分散于DNA中;另一種是CpG高度集中在一起，也稱CpG島。雖然CpG島只占基因組DNA的1%，但存在于所有管家基因的5’端調(diào)控區(qū)，經(jīng)常覆蓋基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子及第1個(gè)外顯子區(qū)。哺乳動(dòng)物基因組中5－甲基胞嘧啶的含量約占總胞嘧啶的3%，并集中在二核苷酸胞嘧啶結(jié)構(gòu)中。

發(fā)生異常甲基化的基因與甲基化結(jié)合蛋白(如MeCP1、MeCP2)及相關(guān)因子(如組蛋白去乙酰化酶HDAC)結(jié)合，造成染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄關(guān)閉使抑癌基因去表達(dá)。甲基化在腫瘤的形成過程中有2個(gè)方面的作用:①甲基胞嘧啶可以使脫氨基轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，造成C－T突變，導(dǎo)致某些基因突變而失活;②抑癌基因甲基化引起相應(yīng)基因沉默，表達(dá)缺失。它們都導(dǎo)致抑癌基因失活，引起腫瘤生長［4］。

DNMT在DNA初始甲基化及甲基化的維持中發(fā)揮著重要作用。DNMT家族至少包括 DNMT1，DNMT2，DNMT3a和 DNMT3b 4個(gè)成員。DNMT1最先被克隆和鑒定，定位于染色體19p12－13。在DNA復(fù)制時(shí)，DNMT1能夠通過其N端結(jié)構(gòu)域與增殖細(xì)胞核抗原(proliferating Cell nuclear antigen，PCNA)結(jié)合，并被PCNA靶向定位于新合成的DNA鏈上。DNMT1因維系著新合成子鏈的甲基化，起著維持甲基化的作用，故顯得尤其重要［5］。DNMT2因缺乏DNMT1和 DNMT3的 N端調(diào)節(jié)區(qū)，故認(rèn)為DNMT2不具備催化CpG位點(diǎn)甲基化的作用，其功能還不清楚。DNMT3亞家族包括DNMT3a和DNMT3b 2個(gè)成員，其基因分別定位于2p23和20q11.2，基因敲除實(shí)驗(yàn)表明DNMT3對于小鼠胚胎植入后的基因組從頭甲基化是必需的。DNMT3b的1個(gè)重要功能是負(fù)責(zé)染色體著絲粒附近區(qū)域微衛(wèi)星序列的甲基化;DNMT3a可能對非CpG序列，如CpA、CpT進(jìn)行甲基化。DNMT活性增強(qiáng)是導(dǎo)致抑癌基因發(fā)生甲基化的重要因素之一。在不同腫瘤細(xì)胞中，不僅有DNMT1參與的甲基化維持過程，也有DNMT3b催化的從頭甲基化。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的DNMT表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞，并與抑癌基因啟動(dòng)子高甲基化狀態(tài)相關(guān)［6］。

腫瘤組織中存在基因組普遍低甲基化和局部區(qū)域過甲基化現(xiàn)象，由此引起原癌基因及促進(jìn)細(xì)胞生長基因激活、抑癌基因及錯(cuò)配修復(fù)基因失活以及染色體不穩(wěn)定等，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

1.2 DNA低甲基化與肺癌

大量研究證據(jù)顯示，人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展常與DNA異常甲基化有關(guān)，與正常對照組織比較，腫瘤組織中基因呈低甲基化狀態(tài)［7］?；蚪MDNA低甲基化可以通過改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)引起基因組的不穩(wěn)定，導(dǎo)致染色體凝聚程度降低，并造成DNA修復(fù)蛋白不易識別、接近該DNA。Wilson等［8］在對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的研究中發(fā)現(xiàn)1q21－q23區(qū)域中的 Bcl－2家族抗凋亡成員MCL－1出現(xiàn)高表達(dá)，并證實(shí)1q21－q23區(qū)域的低甲基化可能是導(dǎo)致MCL－1過度表達(dá)的原因，說明原癌基因的低甲基化參與肺癌的形成過程。

1.3 抑癌基因的高甲基化與肺癌

在肺癌發(fā)生過程中，基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生異常甲基化是1種常見現(xiàn)象［9］。目前已從肺癌腫瘤組織標(biāo)本、細(xì)胞系、支氣管上皮標(biāo)本、痰液標(biāo)本及血液標(biāo)本檢測到多種基因發(fā)生了甲基化。抑癌基因的啟動(dòng)子CpG島的高甲基化是目前腫瘤表觀修飾研究的熱點(diǎn)，下面就幾種肺癌中研究較多的抑癌基因進(jìn)行說明。

1.3.1 p16基因 P16基因又稱多腫瘤抑制基因(MTS1)，是人類腫瘤中最常見的抑癌基因，是細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑。人p16基因定位于9p21，全長815 kb，其基因產(chǎn)物為 p16INK4a和p19ARF。p16在多種腫瘤中表達(dá)失活，以基因突變、啟動(dòng)子區(qū)甲基化或純合缺失為主要失活方式，發(fā)生在非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)中p16啟動(dòng)子甲基化頻繁發(fā)生。國內(nèi)黨偉等［10］研究肺癌患者p16基因甲基化率為24.14%(14/58)，而對照組沒有發(fā)現(xiàn)甲基化。其中，p16蛋白陽性者甲基化率為7.4%，而p16蛋白陰性者中甲基化率為38.7%，差異有顯著性(χ2=7.72，P=0.006)。結(jié)論:p16 基因外顯子 E1 及調(diào)控序列HapII位點(diǎn)異常甲基化，可抑制p16蛋白表達(dá)，這可能是p16基因功能喪失的1個(gè)重要機(jī)制，并可能對肺癌發(fā)生起促進(jìn)作用。Kim等［11］采用甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)對335例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織標(biāo)本的p16等5個(gè)基因甲基化狀況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)p16甲基化發(fā)生率為35%;并回顧性分析NSCLC患者復(fù)發(fā)率與生存率之間的關(guān)系，分析結(jié)果為p16基因甲基化使NSCLCⅠ期患者腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)增加，同時(shí)使手術(shù)后的生存率降低。此項(xiàng)研究說明，p16甲基化是評估NSCLCⅠ期患者復(fù)發(fā)的有價(jià)值的生物腫瘤標(biāo)記物。

1.3.2 MGMT O6－甲基鳥嘌啉－DNA－甲基轉(zhuǎn)移酶(O6－methylguanine DNA methyltranse，MGMT)是1種高效 DNA直接修復(fù)酶，能修復(fù)DNA序列中6－氧－甲基鳥嘌啉損傷，是人類細(xì)胞中迄今發(fā)現(xiàn)的唯一1種修復(fù)該損傷的甲基轉(zhuǎn)移酶，對維持基因組穩(wěn)定性有重要意義。MGMT在肺癌發(fā)生、診斷和治療中具有重要意義。從107例非小細(xì)胞肺癌切除標(biāo)本和相應(yīng)的正常肺組織標(biāo)本中檢測DNA，在肺癌組織中21%的MGMT發(fā)生甲基化［12］。

1.3.3 CDH1 CDH1是1個(gè)介導(dǎo)細(xì)胞間黏附的基因，位于染色體16q221，其編碼的蛋白 E－cadherin(E－cad)是一跨膜糖蛋白，介導(dǎo)ca2+依賴的同型細(xì)胞間黏附以確保上皮細(xì)胞正常表型的維持。CDH1表達(dá)程度與NSCLC臨床分期呈負(fù)相關(guān)，表達(dá)下調(diào)有利于腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移;CDH1甲基化伴E－cad蛋白表達(dá)減少的NSCLC患者比CDH1未甲基化和E－Cad蛋白表達(dá)陽性者預(yù)后差，提示CDH1基因甲基化與NSCLC患者預(yù)后關(guān)系密切。國內(nèi)楊蘭輝等［13］應(yīng)用半定量熒光MSP檢測50例肺癌患者的癌、癌旁和遠(yuǎn)癌肺組織及5例非肺癌對照肺組織標(biāo)本中的CDH1甲基化的相對比值，研究認(rèn)為CDH1基因甲基化水平與肺癌存在相關(guān)性，與肺癌的組織類型無相關(guān)性。說明CDH1異常甲基化和E－cad表達(dá)的減弱和缺失可能是肺癌發(fā)生和發(fā)展過程中的重要因素。國外研究者在肺癌的癌組織中發(fā)現(xiàn)該基因的甲基化率在43% ～50%之間［14，15］，甲基化水平高于國內(nèi)研究結(jié)果。

1.3.4 RASSF1A Ras 相關(guān)區(qū)域家族 1A(Ras association domain family 1A，RASSF1A)是2000年發(fā)現(xiàn)的新型候選抑癌基因，位于3p21.3。RASSF1A基因全長1873 bp，是Ras凋亡家族成員，包含2個(gè)啟動(dòng)子和6個(gè)外顯子，在其啟動(dòng)子區(qū)域存在16個(gè)CpG位點(diǎn)。RASSF1A作為1種腫瘤抑制基因，參與Ras/RASSFl/ERK通路的信號傳導(dǎo)，通過抑制Ras激活生長效應(yīng)信號的傳導(dǎo)途徑，使其喪失抑制生長、促進(jìn)凋亡和衰老的功能而發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生的作用［16］。研究表明，啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的異常甲基化是導(dǎo)致RASSF1A失活的主要機(jī)制，是肺癌發(fā)生的早期事件，也是肺癌的發(fā)展步驟之一。國內(nèi)學(xué)者張卉等［17］研究的150例NSCLC中58例發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子存在甲基化(38.7%)，34例癌旁正常組織和20例肺部良性病變無1例發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子甲基化。RASSF1A啟動(dòng)子甲基化與年齡、性別、吸煙指數(shù)、組織類型、TNM臨床分期均無關(guān)(P＞0.05)，與開始吸煙年齡、腫瘤分化程度相關(guān)，表明RASSF1A啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可以作為NSCLC診斷的1個(gè)候選分子標(biāo)志。Tomizawa等［18］對110個(gè)臨床Ⅰ期肺腺癌進(jìn)行篩選，有35例(32%)發(fā)生了甲基化，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)RASSF1A甲基化多出現(xiàn)在低分化腫瘤細(xì)胞中，并且多出現(xiàn)在血管侵襲和胸膜侵襲處，RASSF1A甲基化患者比非甲基化患者預(yù)后差。

1.3.5 FHIT 脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine triad，F(xiàn)HIT)基因是目前公認(rèn)的腫瘤抑制基因，與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其甲基化所導(dǎo)致的蛋白表達(dá)異常是腫瘤發(fā)生危險(xiǎn)程度的1種標(biāo)志，位于人染色體3p14.2區(qū)域FRA3B脆性位點(diǎn)，編碼系列含組氨酸三聯(lián)體;FHIT蛋白由147個(gè)氨基酸組成，定位于細(xì)胞質(zhì)，是1種典型的二腺苷三磷酸水解酶。FHIT基因的異常表達(dá)主要表現(xiàn)在等位基因缺失(LOH)、啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致胚胎期基因沉默等，但僅僅只有雜合性缺失并不完全抑制FHIT蛋白表達(dá)。啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色。國內(nèi)楊志慧等［19］研究認(rèn)為FHIT基因異常甲基化在肺癌組織中的發(fā)生率明顯高于癌旁組織，兩者差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(68.3%，35.0%，P ＜0.001);FHIT 基因甲基化的發(fā)生率在FHIT蛋白陰性患者中高于陽性表達(dá)者(83.3%vs 53.5%，P＜0.05);FHIT蛋白表達(dá)及基因甲基化發(fā)生率均與性別、年齡、吸煙狀況、組織學(xué)類型、大體分型、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，是影響無瘤生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素，與Liopoulos等［20］的研究結(jié)果相一致。

1.4 DNA甲基化與肺癌的治療

基因的甲基化可以通過甲基化藥物逆轉(zhuǎn)，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長，甲基化的基因經(jīng)去甲基化藥物5－氮雜胞苷處理后可以重新表達(dá)。這種藥物可以誘導(dǎo)細(xì)胞重新表達(dá)。

1.4.1 腺苷類DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑 包括5－氮雜胞苷及其同源物5－氮－2，脫氧胞苷，具有細(xì)胞毒性，還可誘導(dǎo)低甲基化。其在DNA復(fù)制過程中與DNA結(jié)合，然后與DNMT通過共價(jià)鍵形成穩(wěn)定的中間體，而使DNMT被俘獲并失活，導(dǎo)致DNA的去甲基化和不表達(dá)基因的重新表達(dá)，一旦停用5－氮雜胞苷和5－氮－2，－脫氧胞苷，異常的基因啟動(dòng)子過甲基化和基因沉默再次出現(xiàn)。骨髓抑制等不良反應(yīng)限制了它們的使用。目前該類藥物更多用于血液系統(tǒng)腫瘤(如骨髓增生異常綜合征)的治療。其對肺癌的療效尚有待于臨床試驗(yàn)的證實(shí)［21］。

1.4.2 非腺苷類DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑 該類藥物直接抑制DNMT的活性，不與DNMT形成共價(jià)復(fù)合物，因此毒性較低。此類藥物為近年來研發(fā)，包括EGCG(綠茶的主要多酚化合物)、RG108(1種經(jīng)軟件篩選的小分子的甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制物)、普魯卡因和MG98(1種反義寡核苷酸)等［21］。這類藥物抑制DNMT的化學(xué)活性，導(dǎo)致CpG島去甲基化。結(jié)腸、食管、前列腺的細(xì)胞系研究都已經(jīng)證明EGCG能夠使甲基化導(dǎo)致的基因沉默重新激活。在肺癌細(xì)胞中，能否有同樣的作用可以進(jìn)一步研究［22］。

2 組蛋白修飾與肺癌

組蛋白的修飾比DNA甲基化復(fù)雜的多，因?yàn)椴煌慕M蛋白(H3和H4)的不同氨基酸(H3末端有7個(gè) Lys和2個(gè) Ser，H4末端有5個(gè)Lys和1個(gè)Ser)可以發(fā)生不同類型的修飾，包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP核糖基化、羰基化等，他們都是組蛋白密碼的基本元素［23］。在組蛋白的修飾中，研究最多的是乙?；?。

2.1 組蛋白乙?；c肺癌

組蛋白乙?；?個(gè)可逆的過程。組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶將乙?；糠洲D(zhuǎn)移到組蛋白氨基末端上的賴氨酸殘基ε一氨基基團(tuán)，組蛋白乙酰化可導(dǎo)致氨基上的正電荷被消除，減少組蛋白與DNA之間的親和力，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子更易接近DNA啟動(dòng)子區(qū)域，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄。因此，組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶是轉(zhuǎn)錄活化因子。組蛋白脫乙?；?histone deacetylase，HDAC)移去乙?；鶊F(tuán)，恢復(fù)組蛋白的正電性，帶正電荷的賴氨酸殘基與DNA之間的相互作用可限制核小體在DNA上的移動(dòng)，使啟動(dòng)子不易接近轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件，抑制轉(zhuǎn)錄。甲基化CpG結(jié)合蛋白2(MeCP2)與HDAC可能存在同一復(fù)合體中，MeCP2通過與HDAC相互作用的抑制轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域結(jié)合甲基化的DNA和募集Sin3抑制轉(zhuǎn)錄。OSADA［24］研究發(fā)現(xiàn)HDAC基因的低表達(dá)和肺癌有關(guān)，原因可能與HDAC抑制肺癌進(jìn)展中的關(guān)鍵基因有關(guān)。

2.2 組蛋白脫乙?；?HDAC)抑制劑與肺癌的治療

根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)和抑制的機(jī)制，可分為短鏈脂肪酸類、環(huán)氧化物、環(huán)肽、苯酰胺類、異羥肟酸類和其他的混合物［25］，包括曲古抑素A、SAHA、Depsipeptide、丙戊酸，以及一些新的HDAC抑制劑如KD5170、R306465，被用于肺癌細(xì)胞株和移植模型的研究。它們的作用機(jī)制仍然未能明確，可能通過多種途徑起作用，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡［26，27］。HDAC抑制劑對正常細(xì)胞具有低毒性，因而成為1種新的抗腫瘤藥，應(yīng)用前景廣泛。

3 聯(lián)合檢測

在肺癌中基因的異常甲基化可能發(fā)生在肺癌早期，這為肺癌的早期診斷提供了可能，提示表觀遺傳改變也可以作為肺癌進(jìn)展及預(yù)后的指標(biāo)。盡管有些抑癌基因在NSCLC中的甲基化發(fā)生的頻率偏低，但是對這些基因的聯(lián)合檢測可以極大地提高腫瘤的陽性檢出率。在NSCLC的診斷中，利用對一些已經(jīng)報(bào)道的抑癌基因甲基化進(jìn)行聯(lián)合檢測，可以使腫瘤陽性檢出率達(dá)到80%以上［28，29］。因此，對多個(gè)基因進(jìn)行聯(lián)合檢測具有更好的臨床應(yīng)用前景。

綜上所述，對于肺癌表觀遺傳學(xué)機(jī)制的探討，甲基化研究仍將是主流，而對于組蛋白修飾的研究更是不可忽視。探討表觀遺傳學(xué)和傳統(tǒng)遺傳學(xué)的關(guān)系更是1個(gè)熱點(diǎn)。采用近年來新建立的DNA甲基化檢測、核酸定量分析和基因芯片技術(shù)，對大量的基因進(jìn)行DNA甲基化檢測或?qū)@些基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析檢測，可能是NSCLC乃至所有腫瘤分子診斷的發(fā)展方向。DNA異常甲基化不僅可以在原發(fā)性肺癌的腫瘤組織、癌前病變組織中檢測到，而且可以在長期吸煙者的血、痰、支氣管表皮脫落細(xì)胞及支氣管刷標(biāo)本中檢測到。因此，構(gòu)建“甲基化基因譜”可鑒別肺癌發(fā)生高危人群。由于基因的異常甲基化不僅是肺癌發(fā)生的早期事件，還可通過5－氮雜胞苷，HDAC抑制劑等藥物將其逆轉(zhuǎn)，使去表達(dá)的基因重新表達(dá)。因此，更深入的了解基因發(fā)生異常甲基化的機(jī)制，不但有助于肺癌的早期診斷，而且有可能為肺癌的防治提供1條新的思路。

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