魏世安

(重慶市涪陵區(qū)龍橋街道畜牧獸醫(yī)站，重慶涪陵 408121)

豬呼吸道綜合征(PRDC)已成為影響?zhàn)B豬業(yè)的重要群發(fā)性疾病之一。豬多殺性巴氏桿菌是豬呼吸道綜合征(PRDC)的重要原發(fā)感染菌或繼發(fā)原菌。因此，其診斷技術(shù)越來(lái)越受到世界各國(guó)的重視。對(duì)多殺性巴氏桿菌的診斷技術(shù)的重要性突顯出來(lái)。現(xiàn)將豬多殺性巴氏桿菌的診斷綜述如下。

一、臨床診斷

多殺性巴氏桿菌是引起多種畜禽巴氏桿菌病的病原體，主要使動(dòng)物發(fā)生出血性敗血病或傳染性肺炎。此菌廣泛分布與世界各地， PRDC的病原可分為原發(fā)和繼發(fā)病原兩類，正常存在與多種健康動(dòng)物的口腔和咽部黏膜，當(dāng)動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體抵抗力低下時(shí)，細(xì)菌侵入體內(nèi)，大量繁殖并致病，發(fā)生內(nèi)源性傳染。

（一）流行病學(xué)特征根據(jù)流行病學(xué)特征多殺性巴氏桿菌病一年四季均可發(fā)病，多在春夏呈暴發(fā),且在同種或不同種動(dòng)物間可互相傳染，蜱和蚤被認(rèn)為是自然傳播的媒介昆蟲。

臨床癥狀表現(xiàn)為病豬突然發(fā)病，死亡率高。多數(shù)體溫升高到41.5℃～42.0℃，食欲減退或廢絕，全身衰弱、臥地不起，煩躁不安，咳嗽氣喘，呼吸困難，心跳加快，頸下咽喉部發(fā)熱、紅腫、堅(jiān)硬，嚴(yán)重者向上蔓延及耳根，向后達(dá)及胸前，糞便干燥或腹瀉，呈暗綠色，并帶有惡臭等為特征疾病。發(fā)病后，迅速死亡，也可能拖延3～5 d。視具體情況而定。

（二）病理剖檢病豬剖檢，可以發(fā)現(xiàn)皮下組織可見出血點(diǎn)，主要病變以咽喉部及其周圍結(jié)締組織、淋巴結(jié)的漿液性出血炎癥和喉頭氣管內(nèi)充滿淡黃色膠胨樣分泌物為特征。可見到大量的膠胨樣淡黃色纖維素漿液。水腫自頸部延至前肢；全身淋巴結(jié)有輕度的腫脹、出血、切面深紅；心包膜有小出血點(diǎn)；肺水腫，呈紅白相間的大理石花紋，肺胸膜表面可見到紅褐色到灰紅色斑點(diǎn)狀病變區(qū)，胸腔積液，大多數(shù)病變?cè)陔跞~，有小指頭到雞蛋大小的局部性化膿灶、出血灶，嚴(yán)重者胸膜常有纖維素性附著物，肺泡腔、細(xì)支氣管、支氣管腔內(nèi)有嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有黏膜上皮纖維素性變化、脫落，肺呈大葉性肺炎，間質(zhì)水腫出血，粘連性纖維素性胸膜炎； 脾有出血。

（三）診斷技術(shù)

1.實(shí)驗(yàn)室微生物學(xué)診斷技術(shù)。實(shí)驗(yàn)室微生物學(xué)診斷可分為以下三部分。

（1）顯微鏡檢查。取病豬的滲出液、心血、肝、脾、淋巴結(jié)、骨髓等新鮮組織涂片或觸片，以瑞氏染色液或堿性美蘭液染色時(shí)，鏡檢可見典型的兩極著色的短桿菌，即菌體兩端染色深，中間淺，無(wú)鞭毛，不形成芽孢，有莢膜，即可初步診斷。純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，可見兩端鈍圓的革蘭氏陰性球桿狀或短桿狀菌。

（2）細(xì)菌分離、培養(yǎng)與鑒定。分離培養(yǎng)可用病豬肺組織、肝臟、心血等新鮮病料，接種鮮血瓊脂平板、馬丁氏血清瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和血清肉湯培養(yǎng)基，馬丁氏血清瓊脂平板上菌落呈圓形、微隆起、灰白色露滴狀，中等大小。在血瓊脂平板上長(zhǎng)成水滴樣小菌落，無(wú)溶血現(xiàn)象。在血清肉湯中培養(yǎng)，開始輕度渾濁，4～6 h后液體變清亮，管底出現(xiàn)粘稠沉淀，震搖后不分散，表面形成菌環(huán)。在麥康凱瓊脂上不生長(zhǎng)。巴氏桿菌可分解葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇和半乳糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖、鼠李糖、楊苷、肌醇和菊糖，產(chǎn)生H2S, 能形成靛基質(zhì)，觸酶和氧化酶均為陽(yáng)性，M.R.和V-P試驗(yàn)均為陰性，石蕊牛乳無(wú)變化，不液化明膠。

（3）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?？捎貌×现瞥?:10懸液，或用已制成的分離培養(yǎng)菌，皮下注射小鼠、家兔或鴿，動(dòng)物多在24～48 h內(nèi)死亡。由于健康動(dòng)物呼吸道內(nèi)?？蓭Ь?，所以應(yīng)參照病畜的生前臨床癥狀和剖檢變化，分離培養(yǎng)、生化特性作出最后診斷。

若要鑒定莢膜抗原和菌體抗原型，則要用抗血清或單克隆抗體進(jìn)行血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)動(dòng)物血清中的抗體，可用試管凝集、間接凝集、瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)或ELISA等方法。

2.PCR診斷技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)作為一種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，具有快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、易于標(biāo)化和操作等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)檢測(cè)標(biāo)本中病原體的核苷酸特異片段具有常規(guī)診斷方法不具備的一些優(yōu)點(diǎn)，且應(yīng)用于細(xì)菌、病毒的診斷及檢測(cè)已有較多的報(bào)道，因此用PCR技術(shù)檢測(cè)多殺性巴氏桿菌對(duì)多殺性巴氏桿菌病的診斷鑒定可取得準(zhǔn)確的結(jié)果。

在PCR的診斷及檢測(cè)中DNA模板的質(zhì)量是影響PCR檢測(cè)靈敏度的個(gè)重要因素。其中細(xì)菌DNA提取可用豬多殺性巴氏桿菌菌落，用常規(guī)SDS裂解法和常規(guī)煮沸裂解法(DNA快速抽提法)提取DNA作為PCR反應(yīng)的DNA模板，且實(shí)踐證明雖然兩種方法敏感度相當(dāng)，但DNA快速抽取法更簡(jiǎn)便、節(jié)時(shí)。同一濃度的多殺性巴氏桿菌分別用這兩種方法DNA，并通過(guò)蛋白核酸測(cè)定儀測(cè)定DNA濃度，兩者差異不大。但由于SDS會(huì)抑制Taq酶活性，必須用酚-氯仿反復(fù)抽提，操作繁瑣，常導(dǎo)致豬多殺性巴氏桿菌DNA提取純度受到影響，而使本PCR方法不穩(wěn)定。與常規(guī)煮沸裂解法比較，在豬多殺性巴氏桿菌的DNA模板處理過(guò)程，配以應(yīng)用快速延伸Taq酶，可縮短PCR操作時(shí)間。

二、總結(jié)

目前對(duì)豬多殺性巴氏桿菌病的診斷常采用實(shí)驗(yàn)室微生物學(xué)診斷，即病變組織的涂片染色鏡檢和病原分離，純化、生化鑒定等方法，但這些方法較繁雜、費(fèi)時(shí)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)作為一種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，具有快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、易于標(biāo)化和操作等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)檢測(cè)標(biāo)本中病原體的核苷酸特異片段具有常規(guī)診斷方法不具備的一些優(yōu)點(diǎn)，且應(yīng)用于細(xì)菌、病毒的診斷及檢測(cè)，在對(duì)豬多殺性巴氏桿菌病以及很多疾病的診斷上已有較多的報(bào)道，展示了PCR方法良好的應(yīng)用前景。

（略）