徐禮臻，王勤章，韓 濤，丁國富，馬克濤，王江平

(1石河子大學醫(yī)學院，新疆石河子832008;2石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院)

糖尿病膀胱病變(DC)的治療仍是當今難點之一，主要原因是對其發(fā)病機制尚缺乏足夠認識。有研究發(fā)現(xiàn)，膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞(ICCs)在DC中起重要作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病豚鼠膀胱中及體外高糖環(huán)境培養(yǎng)下，ICCs有形態(tài)、數(shù)量和超微結(jié)構(gòu)的異常［1，2］。那么，是否正是由于高糖環(huán)境造成了ICCs的損害從而引起DC呢?為驗證這一推論，2010年10月～2011年7月，我們觀察了體外模擬高糖環(huán)境培養(yǎng)下ICCs具有起搏特征的內(nèi)向電流變化，旨在探討與膀胱自主收縮起搏密切相關(guān)的ICCs在DC發(fā)生、發(fā)展中的可能作用和病理生理學意義。

1 材料與方法

1.1 材料 健康豚鼠15只，3～4個月齡，雌雄不限，體質(zhì)量500～700 g。主要試劑:磷酸鹽緩沖液(PBS)，DMEM細胞培養(yǎng)液，D-葡萄糖，膠原酶。一抗為小鼠抗大鼠CD117抗體，即酪氨酸蛋白激酶受體(c-kit)蛋白特異性抗體;二抗為FITC標記山羊抗小鼠抗體，恒溫細胞培養(yǎng)箱。實驗用細胞外液成分(mmoL/L):NaCl 135，KCl 5，CaCl25，HEPES 5，D-Glucose 10，外液滲透壓約 825.2 kPa，用 NaOH 將pH調(diào)至7.3。細胞內(nèi)液成分(mmoL/L):Kgluconate 135，MgCl25，EGTA 1.1，HEPES 5，MgATP 5，Na2ATP 0.5，內(nèi)液滲透壓約 773.6 kPa，用 KOH 將 pH 調(diào)至7.2。主要儀器和設(shè)備:Olympus IX71倒置顯微鏡，制作玻璃電極用的毛胚(外直徑1.5 mm，內(nèi)直徑為0.84 mm)，P97程控玻璃微電極拉制儀，Axonpatch-700B膜片鉗放大器，MX7600R＆MX10L微操縱器。

1.2 方法

1.1 豚鼠膀胱ICCs的培養(yǎng)與分組 頸椎脫臼法處死豚鼠，無菌條件下取出膀胱，剝除膀胱黏膜層和漿膜層，剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊;經(jīng)0.1%膠原酶Ⅴ37℃消化90min，離心后棄膠原酶PBS沖洗，加入DMEM培養(yǎng)基(含80%DMEM，20%FBS，1%ml Antibi-antibiotic)，充分吹打后將細胞懸液滴于6孔板內(nèi)事先放置的蓋玻片上。各孔分別加入2 ml培養(yǎng)液，靜置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后換液;分別加入含葡萄糖5(對照組)、15(高糖Ⅰ組)、30 mmol/L(高糖Ⅱ組)的細胞培養(yǎng)液，各兩孔;培養(yǎng)72 h后，取出蓋玻片。

1.2 豚鼠膀胱ICCs的內(nèi)向電流檢測方法 采用全細胞膜片鉗實驗。取接種有目標細胞的玻片，轉(zhuǎn)入倒置顯微鏡下的灌流槽中;在室溫下(22～25℃)用灌流液對標本持續(xù)灌流(0.2 ml/min)，此時在倒置顯微鏡下可根據(jù)細胞的光鏡特征分辨出平滑肌細胞和ICCs。采用P97水平微電極拉制儀拉制微電極，沖灌電極內(nèi)液;將電極固定在電極夾持器上與放大器相連，使用倒置顯微鏡找到目標細胞;迅速將電極靠近細胞，通過微操縱器使電極尖端接觸到目的細胞并輕壓之;撤除玻璃電極內(nèi)的正壓，并給予負壓形成GΩ封接(封接阻抗在1 G以上);再對玻璃電極內(nèi)部給予短促較強的負壓擊破細胞膜，破膜后即可對細胞進行電壓鉗制，建立全細胞記錄模式，進行全細胞膜片鉗實驗。微電極內(nèi)灌充電極液，選擇電壓鉗模式，輸出各類刺激信號。設(shè)置鉗制電壓(HP)為－60 mV，給予細胞一系列時程1 600 ms的超極化刺激(檢測電壓每步階躍10 mV，從－50 mV均跳至－150 mV)。以膜電位超極化至－110 mV時的內(nèi)向電流大小代表最大電流。做過內(nèi)向電流記錄后的ICCs外液中加入2 mmol/L的CsCl，內(nèi)向電流能被特異性阻斷。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

對照組膀胱ICCs的內(nèi)向電流數(shù)值為(505.75±157.660)pA，高糖Ⅰ組為(349.25 ±71.087)pA，高糖Ⅱ組為(95.00±33.337)pA。組間比較，P均 ＜0.01。

3 討論

內(nèi)向電流是起搏細胞的特征性電流［3］，同時也是ICCs具有起搏功能的一個間接證據(jù)。而介導內(nèi)向電流的分子基礎(chǔ)是超極化激活環(huán)核苷酸門控通道(HCN)［4，5］。由于 HCN 可被細胞外 Cs+快速結(jié)合而發(fā)生阻滯，故我們在對ICCs檢測出內(nèi)向電流之后給予了2 mmol/L的CsCl，發(fā)現(xiàn)該電流能被迅速阻滯，從而說明此電流就是我們所要測量的內(nèi)向電流。

我們前期的研究［6，7］表明，高糖環(huán)境培養(yǎng)下的ICCs會發(fā)生形態(tài)和胞內(nèi)鈣離子熒光值改變，且ICCs具有自發(fā)的Ca2+震蕩特性。本研究進一步采用電生理方法，證實了ICCs不僅具有起搏細胞特性的內(nèi)向電流，而且發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境對ICCs電生理功能影響顯著，并且該影響會隨糖濃度增加而增強。

膀胱逼尿肌組織能夠產(chǎn)生不受神經(jīng)系統(tǒng)控制的自發(fā)性動作電位，ICCs可能就是理論上存在于膀胱的起搏細胞。結(jié)合本研究的結(jié)果，我們認為糖尿病的高糖環(huán)境造成了ICCs電生理機能的損害，這可能是導致糖尿病膀胱病變的原因之一。

細胞培養(yǎng)是研究細胞功能所常用的一種實驗方法。由于膜片鉗檢測時要求被檢測細胞保持良好的電生理活性，并且培養(yǎng)后的ICCs在進行膜片鉗檢測時難免會受到其周圍環(huán)境中其他細胞及雜質(zhì)所引起的電化學干擾，因此體外培養(yǎng)下的ICCs電生理參數(shù)并不能完全代替其真實生理狀態(tài)下的情況。此外，參與膀胱起博活動的ICCs的離子通道和自發(fā)電活動引起興奮收縮的傳播機制，以及其與糖尿病膀胱病變之間的關(guān)系目前尚未揭示清楚，還有待于進一步研究。

［1］王勤章，紀世琪，朱國棟，等.糖尿病豚鼠膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞形態(tài)學變化及意義［J］.臨床與實驗病理學雜志，2009，25(6):631-634.

［2］范勇洪，丁國富，王勤章，等.高糖環(huán)境對豚鼠膀胱ICCs細胞超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2009，9(23):4422-4424.

［3］Robinson RB，Siegelbaum SA.Hyperpolarization-activated cation currents:from molecules to physiological function［J］.Annu Rev Physiol，2003，65(11):453-480.

［4］Santoro B，Liu DT，Yao H，et al.Identification of a gene encoding a hyperpolarization-activated pacemaker channel of brain［J］.Cell，1998，93(5):717-729.

［5］Santoro B，Tibbs GR.The HCN gene family:molecular basis of the hyperpolarization-activated pacemaker channels［J］.Ann NY Acad Sci，1999，868(4):741-764.

［6］蔡志強，王勤章，丁國富，等.豚鼠膀胱Cajal樣細胞在高糖環(huán)境中的形態(tài)學變化［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2009，9(22):4248-4250.

［7］劉新軍，王勤章，丁國富，等干細胞因子對高糖環(huán)境下豚鼠膀胱Cajal樣間質(zhì)細胞形態(tài)及電生理的影響［J］.現(xiàn)代泌尿外科雜志，2011，16(2):102-110.