邱曉菲,張師前,馬曉晉

(1滕州市中心人民醫(yī)院,山東滕州 277500;2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中存在多個(gè)基因的表達(dá)異常,實(shí)現(xiàn)基因功能表達(dá)的最終物質(zhì)是蛋白質(zhì)。因此,直接測定蛋白質(zhì)的水平和活性是了解細(xì)胞活動(dòng)的最好辦法。“差異”蛋白質(zhì)組學(xué)是腫瘤標(biāo)志物篩選的一個(gè)突破口[1]。近年來,以激光捕獲顯微切割(LCM)技術(shù)、雙向凝膠電泳、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤的研究。LCM與現(xiàn)代質(zhì)譜相結(jié)合已成為腫瘤標(biāo)志物篩選的理想技術(shù)[2]。2010年9月,我們采用LCM和MALDI-TOF-MS對高同質(zhì)性宮頸鱗癌組織細(xì)胞及正常宮頸細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的比較研究,以期獲取宮頸鱗癌的分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 宮頸鱗癌組織及正常宮頸組織的獲取 人宮頸鱗癌組織及癌旁正常宮頸組織取自山東省立醫(yī)院和滕州市中心人民醫(yī)院的宮頸癌手術(shù)切除標(biāo)本,其中宮頸鱗癌 5例份、癌旁正常宮頸組織 4例份。宮頸癌患者未接受放療或化療。獲取組織 4℃冰鹽水沖洗3～5次,均勻分割成0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm組織塊,分裝于 0.5 m l離心管中,先置液氮中速凍,置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 組織切片的制備及染色 取備檢組織,OTC包埋,-25℃切片,厚 8μm。每例標(biāo)本第1張切片行HE染色,以后每張切片85%、95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇脫水各30 s,無水乙醇2min固定2次。將制備好的組織切片置顯微鏡載物臺,直視下觀察選定要切割的區(qū)域,按最大捕獲效率設(shè)定參數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞捕獲 采用LCM技術(shù)。將切片置于PALM顯微激光切割系統(tǒng) 10×10倍目鏡直視觀察,選定要切割的區(qū)域。按照如下條件進(jìn)行激光捕獲：激光能量60%,激光脈沖80 steps/sec。每個(gè)樣品捕獲 50 000～60 000個(gè)細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞總蛋白提取 將LCM捕獲的單一類型宮頸癌細(xì)胞群及癌旁正常宮頸細(xì)胞分別使用組織裂解緩沖液提取總蛋白,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 蛋白雙向凝膠電泳 取上述蛋白質(zhì)樣品100μg加入重泡脹液至終體積 350μl。將樣本均勻加入持膠槽中,膠面向下放入17 cm IPG干膠條,滴加礦物油,置等電聚焦儀,重泡脹過夜。等電聚焦后,IPG膠條分別在平衡液A(含20 g/LDTT)和B(含25 g/L碘乙酰胺)中各平衡15min。將平衡后的IPG膠條置12%的均勻SDS聚丙烯酰胺凝膠上方,膠條端滴加寬范圍的蛋白標(biāo)記物,低溶點(diǎn)瓊脂糖封閉,電泳參數(shù)：5 mA/膠 1 h,待溴酚藍(lán)前沿移入SDS膠時(shí),以30mA/膠6 h直至溴酚藍(lán)前沿抵達(dá)距膠底邊緣約0.5 cm時(shí)為止。

1.2.5 凝膠染色 根據(jù)蛋白質(zhì)銀染試劑盒的操作說明對2-D膠進(jìn)行銀染。用Proteineer SPSpectrometer掃描凝膠蛋白質(zhì)獲取圖像,確定高度表達(dá)的特異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。

1.2.6 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定 選取膠上差異蛋白質(zhì)點(diǎn),用刀片沿斑點(diǎn)染色邊緣切下,置Eppendof管,按Gharahdaghi等方法進(jìn)行蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解,37℃孵育過夜。萃取后,合并多肽混合物提取液。利用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀對肽混合物提取液進(jìn)行分析,獲得寡肽的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。將質(zhì)譜數(shù)據(jù)輸入MASCOT 2.2蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,對該蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

通過LCM技術(shù)可以準(zhǔn)確、快速地分離宮頸鱗癌細(xì)胞、間質(zhì)組織,得到同質(zhì)性腫瘤細(xì)胞。利用雙向凝膠電泳對搜集獲取的單一類型宮頸腫瘤細(xì)胞群和正常宮頸細(xì)胞配對樣本進(jìn)行分析后得到蛋白質(zhì)凝膠電泳銀染圖譜。通過掃描凝膠影像,顯示 20個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)量存在明顯差異(P均 ＜0.01)。利用MALDI-TOF-MS成功鑒定出5種差異蛋白,其中ETS1、HSP60、Bcl-2、C-myc、TIF1-β蛋白在宮頸鱗癌細(xì)胞表達(dá)明顯增高(P均＜0.05)。

3 討論

目前認(rèn)為,宮頸癌的形成是一個(gè)涉及正常細(xì)胞生長改變和基因改變的復(fù)雜的多階段過程。本研究應(yīng)用LCM和MALDI-TOF-MS技術(shù),對高同質(zhì)性宮頸鱗癌浸潤組織細(xì)胞及正常宮頸組織細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的比較研究,成功鑒定出 5種差異蛋白,其中ETS1、HSP60、Bcl-2、C-myc、TIF1-β蛋白在宮頸鱗癌細(xì)胞表達(dá)明顯增高。ETS家族是一類轉(zhuǎn)錄因子,在組織的變異、淋巴組織的增生和血管生成等方面發(fā)揮作用。ETS發(fā)揮作用時(shí)與其聯(lián)合蛋白密切相關(guān)[3]。ETS-1蛋白的高表達(dá)可能與宮頸鱗癌的發(fā)生及浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)。HSP60蛋白定位于宮頸癌細(xì)胞的胞質(zhì)中,在宮頸癌組織中過度表達(dá)[4],有可能成為宮頸癌早期診斷和治療的重要標(biāo)志。C-myc癌基因?qū)俸说鞍谆?具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力,并具有與 DNA結(jié)合的特性,在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化及惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用[5]。本研究表明,Bcl-2蛋白在宮頸鱗癌細(xì)胞高表達(dá),而正常宮頸組織細(xì)胞低表達(dá),表明Bcl-2基因與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。有報(bào)道[6],Bcl-2基因的過度表達(dá)并不影響細(xì)胞增殖,而是阻止細(xì)胞凋亡,使腫瘤細(xì)胞得以生存。本研究發(fā)現(xiàn),TIF1-β蛋白在宮頸鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)。TIF1-β是一種轉(zhuǎn)錄中介因子,在諸多轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體中起橋梁作用,參與形成具有組蛋白甲基化酶或組蛋白去乙酰化酶活性的復(fù)合體,通過中間的HP1BD區(qū)域與HP1蛋白相互作用,進(jìn)而與組蛋白相結(jié)合[7]。

綜上所述,本研究采用LCM技術(shù)成功獲取了同質(zhì)宮頸癌細(xì)胞和正常宮頸細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌和正常宮頸細(xì)胞的2-DE蛋白質(zhì)圖譜具有明顯的差異表達(dá),并成功鑒定出部分差異蛋白,該差異蛋白組可望作為宮頸鱗癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的潛在預(yù)測指標(biāo)及治療的分子靶點(diǎn)。

[1]Yim EK,Park JS.Role of proteomics in translational research in cervical cancer[J].Expert Rev Proteomics,2006,3(1)：21-36.

[2]Gutstein HB,Morris JS.Laser capture sampling and analytical issues in proteom ics[J].Expert Rev Proteom ics,2007,4(5)：627-637.

[3]Fujimoto J,Aoki I,Toyoki H,etal.Clinical implicationsof expression of ETS-1 related to angiogenesis in uterine cervical cancers[J]. Ann Oncol,2002,13(10)：1598-1604.

[4]Hwang YJ,Lee SP,Kim SY,et al.Expression of heat shock protein 60 kDa is upregulated in cervical cancer[J].Yonsei Med J, 2009,50(3)：399-406.

[5]Gao P,Tchernyshyov I,Chang TC,et al.C-myc suppression of miR-23a/b enhancesmitochondrial glutaminase expression and glutaminemetabolism[J].Nature,2009,458(7239)：762-765.

[6]Rughooputh S,Manraj S,Eddoo R,et al.Expression of the C-myc oncogene and the presence of HPV 18：possible surrogate markers for cervical cancer[J].Br JBiomed Sci,2009,66(2)：74-78.

[7]OkinoK,Nagai H,NakayamaH,etal.Inactivation ofCrk SH 3domain-binding guanine nucleotide-releasing factor(C3G)in cervical squamous cell carcinoma[J].Int JGynecol Cancer,2006,16(2)：763-771.