劉 潔,鐘 鳴,李自娟,朱 莉,郭 艷,任美思

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心,沈陽 110001;2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院)

細(xì)胞周期蛋白G2(CCNG2)是細(xì)胞周期調(diào)控的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,可阻抑細(xì)胞周期進(jìn)程,抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[1～3]。迄今為止,關(guān)于其功能和調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明,本研究中我們構(gòu)建了以綠色熒光蛋白(GFP)為報(bào)告基因的CCNG2融合表達(dá)載體并進(jìn)行鑒定,為進(jìn)一步探討該基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人舌鱗癌細(xì)胞Tca-8113由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。Marthon human adult brain cDNA文庫、Gateway pENTR1A載體、pcDNA6.2TM/EmGFP-DESTGateway載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、LR Clonase Kit、Lipofectamine2000、Opti-MEM購自美國(guó)Invitrogen公司;In-Fusion TM Advantage PCR Cloning Kit購自美國(guó)Clontech公司;betaine、ΦX174/HaeⅢ、λ/HindⅢ相對(duì)分子質(zhì)量Marker、KOD Plus Kit購自日本ToYoBo公司;EcoRⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶購自英國(guó)Neb公司;蛋白酶K、Wizard Plus SV Minipreps質(zhì)粒純化試劑盒購自美國(guó)Promega公司;LB培養(yǎng)基、氨芐青霉素購自美國(guó)Sigma公司;RPMI1640、胰蛋白酶、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司;RNAiosTM Plus RNA提取試劑、DEPC、SYBR Prime Script RT-PCR KitⅡ購自大連TaKaRa公司;實(shí)驗(yàn)中所有引物均由大連TaKaRa公司合成,測(cè)序分析由上海生工公司完成。

1.2 方法

1.2.1 人CCNG2全長(zhǎng)cDNA克隆 以Marthon human adultbrain cDNA為模板,根據(jù)GenBank基因序列(NM_004354.2)設(shè)計(jì)引物,引物的5'端引入ECoR I和Not I酶切位點(diǎn),PCR擴(kuò)增人CCNG2全長(zhǎng)開放閱讀框。

1.2.2 pENTR1A-G2入門克隆構(gòu)建 將獲得的產(chǎn)物稀釋100倍作為模板,設(shè)計(jì)In-Fusion TM Advantage PCR Cloning Kit專用引物,進(jìn)行大規(guī)模PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳分離、回收、純化后與ECoR I/NotⅠ雙酶切的pENTR1A進(jìn)行In-Fusion克隆。菌落PCR鑒定參照質(zhì)粒提取和純化試劑盒說明制備pENTR1A-G2質(zhì)粒,ECoRⅠ/NotⅠ酶切鑒定,測(cè)序分析。

1.2.3 pcDNA6.2-EmGFP-G2表達(dá)克隆構(gòu)建 利用Gateway重組技術(shù)將CCNG2 cDNA序列從pENTR1A-G2轉(zhuǎn)到pcDNA 6.2-EmGFP-DEST載體,取1 μl產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,涂布含有氨芐青霉素(100 μg/m l)的LB瓊脂平板,37℃培養(yǎng)過夜。質(zhì)粒的提取和鑒定方法同前,新構(gòu)建的質(zhì)粒命名pcDNA6.2-EmGFP-G2。

1.2.4 pcDNA6.2-EmGFP-G2亞細(xì)胞定位 胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca-8113細(xì)胞,用Opti-MEN制成 1×106/m l的單細(xì)胞懸液接種于 6孔板中,24 h后待細(xì)胞長(zhǎng)滿至 85%～90%時(shí),參照 Lipofectamine 2000的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染4 h后,換正常培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,DAPI染色5 min,激光共聚焦顯微鏡觀察。實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組、pcDNA6.2-EmGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和pcDNA6.2-EmGFP-G2轉(zhuǎn)染組,正常對(duì)照組未進(jìn)行轉(zhuǎn)染,另外兩組分別轉(zhuǎn)染 pcDNA6.2-EmGFP空質(zhì)粒和pcDNA 6.2-EmGFP-G2。

1.2.5 CCNG2基因mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR法。提取轉(zhuǎn)染后Tca-8113細(xì)胞總RNA,利用Random 6 mers和Oligo(dT)Primer反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板,MAPK為看家基因,CCNG2為目的基因,SYBR GreenⅠ嵌合熒光法進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。MAPK上游引物為5'-AAACATGATACTCCTGTGGTGCAGA-3',下游引物為5'-CAAGCTTTAGGTAAACCTGGTGCAA-3';CCNG2上游引物為5'-AGCTTGCAACTGCCGACTCA-3',下游引物為5'-TCGGCTAGGCATTTAGAAACCAAC-3'。反應(yīng)條件95℃30 s,95℃5 s,60℃34 s,95℃15 s 40個(gè)循環(huán),60℃1 min,95℃15 s。利用MxPro-Mx3000P v4.10 Real-Time Analysis Software進(jìn)行采集和分析數(shù)據(jù)。結(jié)果分析采用 2-ΔΔCt相對(duì)定量法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,組間比較采用One-way ANOVA方差分析,P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pENTR1A-G2入門克隆鑒定 經(jīng)1%瓊脂糖電泳可見到在1 078 bp左右出現(xiàn)一特異性條帶,與預(yù)計(jì)的克隆產(chǎn)物大小相符。連接pENTR1A轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,挑取15個(gè)較大的菌落,以CCNG2-Eco-FInFu和CCNG2-Not-R-InFu為引物進(jìn)行菌落PCR反應(yīng),篩選出 5個(gè)陽性菌落,擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒, ECoRⅠ和NotⅠ酶切得到1 032 bp和2 700 bp兩條DNA條帶,鑒定正確,經(jīng)測(cè)序證實(shí)與CCNG2序列一致。

2.2 pcDNA6.2-EmGFP-G2鑒定 PCR篩選出5個(gè)陽性克隆,提取質(zhì)粒后,ECoRⅠ/NotⅠ酶切得到1 032 bp和7 500 bp兩條DNA條帶,經(jīng)測(cè)序證實(shí)CCNG2正確插入到pcDNA6.2-EmGFP載體中。

2.3 pcDNA6.2-EmGFP-G2在細(xì)胞中表達(dá) pcDNA6.2-EmGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組可見整個(gè)細(xì)胞均勻分布的綠色熒光,而正常對(duì)照組未見有熒光。pcDNA6.2-EmGFP-G2轉(zhuǎn)染組的綠色熒光信號(hào)除在胞質(zhì)中彌漫分布,在部分細(xì)胞的胞核DAPI染色弱信號(hào)區(qū)濃聚。

2.4 CCNG2 mRNA表達(dá) 與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比, pcDNA6.2-EmGFP-G2轉(zhuǎn)染組CCNG2mRNA表達(dá)量增加了9.47倍(P＜0.01);正常對(duì)照組和空質(zhì)粒組CCNG2 mRNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

CCNG2基因定位于人類染色體 4q21.1位置,全長(zhǎng)5 489 bp,含有8個(gè)外顯子,編碼一個(gè)由 344氨基酸組成的蛋白,表達(dá)具有組織特異性并受細(xì)胞周期嚴(yán)格調(diào)控[4];DNA損傷藥物、抑癌基因VHL基因產(chǎn)物可以誘導(dǎo)其非 p53依賴性表達(dá)上調(diào)[5,6],FoxO和 Hoxa-10亦參與調(diào)控其表達(dá)[7,8]。并與蛋白質(zhì)磷酸脂酶2A(PP2A)關(guān)系密切,CCNG2在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或高分化的喉癌組織中其表達(dá)較高,而在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或病理低分化的喉癌中表達(dá)下降,并可作為判斷患者預(yù)后的指標(biāo)之一[9]。甲狀腺腺瘤和乳頭狀癌中 CCNG2的表達(dá)水平較正常甲狀腺濾泡組織明顯降低,腺瘤的表達(dá)水平明顯高于腺癌[10]?？谇击[癌組織中CCNG2表達(dá)明顯降低[11]。CCNG2高表達(dá)的急性白血病患者復(fù)發(fā)率明顯低于低表達(dá)者,耐藥者明顯低于敏感者[12]。

GFP是研究基因功能的便利工具,可與多種目的基因融合而不影響產(chǎn)物的空間構(gòu)象和功能。熒光靈敏度高,光譜穩(wěn)定性好,抗光漂白能力強(qiáng)。根據(jù)哺乳動(dòng)物的密碼子對(duì)野生型GFP氨基酸進(jìn)行替代改造,獲得增強(qiáng)型 GFP,其熒光強(qiáng)度大大提高,增強(qiáng)了作為報(bào)告基因的敏感度。pcDNA6.2TM/EmGFPDESTGateway含有的Emerald GFP(EmGFP)就是這樣的增強(qiáng)型GFP突變體,其GFP突變位點(diǎn)為S65T、S72A、N149K、M153T、I167T,激發(fā)波長(zhǎng)為487 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為509 nm。

In-Fusion技術(shù)是近年來新興的一種克隆技術(shù),具有簡(jiǎn)單、方便、高效、快捷的特點(diǎn)[13],本研究首先從成人腦cDNA文庫中擴(kuò)增出CCNG2基因ORF,使用In-Fusion技術(shù)該片段亞克隆到入門載體pENTR1A中形成入門克隆pENTR 1A-G2,經(jīng)過菌落PCR、酶切和測(cè)序驗(yàn)證pENTR1A-G2成功構(gòu)建。Gateway重組克隆技術(shù),可實(shí)現(xiàn)載體在多個(gè)目的表達(dá)系統(tǒng)間的平行轉(zhuǎn)移和基因的快速克隆,保持插入方向及閱讀框不發(fā)生變化。pENTR1A中包含有attL1和attL2特異性位點(diǎn),pcDNA6.2TM/EmGFPDEST載體在CMV啟動(dòng)子下游有兩個(gè)重組位點(diǎn)attR1和attR2,在LR ClonaseⅡ酶介導(dǎo)下25℃作用1 h,attL1/attL2與attR1/attR2兩特異位點(diǎn)間發(fā)生準(zhǔn)確的重組反應(yīng)。經(jīng)菌落PCR、酶切和測(cè)序驗(yàn)證CCNG2基因被成功插入pcDNA6.2-EmGFP載體。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Tca-8113細(xì)胞后觀察看到胞質(zhì)中彌漫分布的綠色熒光信號(hào),經(jīng)熒光定量PCR驗(yàn)證pcDNA 6.2-EmGFP-G2轉(zhuǎn)染組CCNG2 mRNA表達(dá)量顯著提高,比空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組增加了 9.47倍。表明該融合載體能在細(xì)胞中高效表達(dá)。我們還發(fā)現(xiàn)在部分細(xì)胞的胞核DAPI染色弱信號(hào)區(qū)呈現(xiàn)極強(qiáng)的綠色熒光濃聚信號(hào),集中于某些細(xì)胞器中,在分布上具有典型的特征。Don等[4]研究認(rèn)為CCNG2是一個(gè)新的中心體結(jié)合蛋白,具有核漿穿梭功能,可以調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性,從而影響 p53依賴性的細(xì)胞周期阻抑,我們推測(cè)該胞核部分可能與中心體或細(xì)胞骨架有關(guān),有待進(jìn)一步深入研究探討。

[1]Yue L,Daikoku T,Hou X,et al.Cyc lin G1 and cyclin G2 are expressed in the periimplantation mouse uterus in a cell specific and progesterone-dependent manner：Evidence for aberrant regulation with Hoxa-10 deficiency[J].Endocrinology,2005,146(5)：2424-2433.

[2]Bennin DA,Don AS,Brake T.Cyclin G2 associates with protein phosphatase 2A catalytic and regulatory B'subunits in active complexesand inducesnuc lear aberrations and a G1/Sphase cell cycle arrest[J].JBiol Chem,2002,277(30)：27449-27464.

[3]Horne MC,Goolsby GL,Donaldson KL.Cyclin G1 and cyclin G2 comprise a new family of cyclins with contrasting tissue-specific and cell cycle-regulated expression[J].JBiol Chem,1996,271(11)：6050-6061.

[4]Don AS,Dallapiazza RF,Bennin DA,et al.Cyc lin G2 is a centrosome-associated nucleocytoplasmic shuttling protein that influences microtubule stability and induces a p53-dependent cell cycle arrest [J].Exp Cell Res,2006,312(20)：4181-4204.

[5]Xu G,Bernaudo S,Fu G,et al.Cyc lin G2 is degraded through the ubiquitin-proteasome pathway and mediates the antiproliferative effect of activin receptor-like kinase 7[J].Mol Biol Cell,2008,19 (11)：4968-4679.

[6]Stossi F,Likhite VS,Katzenellenbogen JA,et al.Estrogen-occupied estrogen receptor represses cyclin G2 gene expression and recruits a repressor complexat the cyclin G2promoter[J].JBiolChem,2006, 281(24)：16272-16278.

[7]Martinez-Gac L,Marqués M,García Z,et al.Control of cyclin G2 mRNA expression by forkhead transcription factors：novelmechanism for cell cyc le control by phosphoinositide 3-kinase and fork-head [J].Mol Cell Biol,2004,24(5)：2181-2189.

[8]Le XF,Arachchige-Don AS,Mao W,et al.Roles of human epidermal growth factor receptor 2c-jun NH2-terminal kinasephosphoinositide 3-kinaseand p70 S6 kinase pathways in regulation of cyc lin G2 expression in human breast cancer cells[J].Mol Cancer Ther, 2007,6(11)：2843-2857.

[9]崔曉峰,李紅,王玎,等.細(xì)胞周期蛋白G2在喉癌中的表達(dá)[J].中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科,2008,15(3)：123-125.

[10]Ito Y,Yoshida H,Uruno T,et al.Decreased expression of cyclin G2 is significantly linked to themalignant transformation ofpapillary carcinoma of the thyroid[J].Anticancer Res,2003,23(3B)：2335-2338.

[11]Kim Y,Shintani S,Kohno Y,et al.Cyclin G2 dysregulation in human oral cancer[J].Cancer Res,2004,64(24)：8980-8986.

[12]賈晉松,徐世榮,馬劼,等.細(xì)胞周期蛋白 G2mRNA在急性白血病患者中的表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2005,13(2)：254-259.

[13]Berrow NS,Alderton D,Sainsbury S,et al.A versatile ligation-independent c loning method suitable for high-throughput expression screening applications[J].Nucleic Acids Res,2007,35(6)：e45.