楊海波，李 昌，陳蘭英，阮鵬飛，高升

(河南城建學(xué)院生物工程系，河南 平頂山 467044)

研究表明，腫瘤細(xì)胞中核基質(zhì)的組成和構(gòu)型與正常細(xì)胞有顯著的差別［1］。2010年6月～2011年2月，我們采用環(huán)六亞甲基雙乙酰胺(HMBA)誘導(dǎo)人食管癌EC9706細(xì)胞分化，觀察了分化過程中細(xì)胞核基質(zhì)蛋白表達(dá)的變化，旨在探討食管癌細(xì)胞分化及其基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌細(xì)胞EC9706由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院楊勝利教授贈(zèng)送。HMBA購自Sigma公司，尿素、硫脲、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、二硫蘇糖醇、甲基磺酸鹽購自上海生工公司，兩性電解質(zhì)購自Pharmcia公司。所有溶液均用Milli-Q水配制［2］。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 人食管癌EC9706細(xì)胞培養(yǎng)在內(nèi)含15%熱滅活小牛血清、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、50 μg/ml 卡那霉素RPMI-1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液 pH 7.2 ～7.4，37 ℃恒溫培養(yǎng)，細(xì)胞接種24 h后分為對(duì)照組和觀察組，對(duì)照組換上新鮮培養(yǎng)液，觀察組換上含5 mmol/L的HMBA作用液進(jìn)行誘導(dǎo)處理，誘導(dǎo)處理5 d后收獲備用［3］。

1.2.2 核基質(zhì)蛋白提取 兩組均加入細(xì)胞骨架提取液CSK100(10 mmol/L PIPES，300 mmol/L蔗糖，100 mmol/L NaCl，3 mmol/L MgCl2，1.2 mmol/L PMSF，0.5%TritonX-100)0 ℃放置10 min，400 g 離心5 min，去除上清液。加入細(xì)胞骨架提取液CSK 50(10 mmol/L PIPES，300 mmol/L蔗糖，50 mmol/L NaCl2，3 mmol/L MgCl2，1.2 mmol/L PMSF，0.5%TritonX-100)洗滌2次，離心，去除上清液。加入300 U/mL DNaseⅠ(CSK 50配制)消化30 min，加入1 mol/L(NH4)2SO4至終濃度 0.25 mol/L，室溫沉淀15 min，1000 g離心5 min，最后 CSK 50洗1次，于－80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?，4］。

1.2.3 核基質(zhì)蛋白表達(dá)檢測 采用雙向凝膠電泳法。①雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳:制備管膠直徑2 mm，長14 cm。核基質(zhì)蛋白樣品加入裂解液(7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，4%CHAPS，50 mmol/L DTT，2% 兩性電解質(zhì)，pH 3.0 ～9.5)，冰浴超聲 2 min，4℃ 16000 g離心30 min，上樣量100 μg，電泳600 V 16 h，1000 V 1 h，等電聚焦電泳結(jié)束后，膠條在平衡緩沖液(5%SDS，50 mmol/L DTT，10% 甘油，0.65 mmol/L Tris，pH 6.8，痕量溴酚藍(lán))中平衡 20 min，轉(zhuǎn)移到1 mm厚13%的SDS-PAGE上部，以1%瓊脂糖封閉，250 V恒壓下，電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的底部。進(jìn)行銀染，采用GDS 8000pc凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，經(jīng)PDQuest軟件分析差異點(diǎn)。②圖像分析:采用凝膠圖像分析軟件PDQuest 8.0(Bio-Rad)行蛋白點(diǎn)的檢測、匹配、定量、標(biāo)準(zhǔn)化及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組細(xì)胞的核基質(zhì)蛋白電泳各有三處重復(fù)，按每個(gè)蛋白點(diǎn)的密度相對(duì)于整張凝膠總密度的比值對(duì)各蛋白點(diǎn)行標(biāo)準(zhǔn)量化，消除上樣量差異，選取表達(dá)水平相差2倍以上的蛋白點(diǎn)。

2 結(jié)果

兩組雙向電泳凝膠圖譜的匹配率均為80%以上，分別檢測到大約132個(gè)蛋白點(diǎn)，其中15個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)具有明顯差異，兩組大多數(shù)核基質(zhì)蛋白分布情況相似，僅少數(shù)蛋白表達(dá)發(fā)生改變。依據(jù)分析的先后順序?qū)ι鲜?5個(gè)核基質(zhì)蛋白點(diǎn)編號(hào)。其中NMP-5、8、12、13、14 僅在觀察組中表達(dá);NMP-1、2、3、4、6、7、9、10、11、15，兩組均有表達(dá)，但觀察組 NMP-7、11、15 表達(dá)明顯減弱，NMP-1、2、3、4、6、9、10 表達(dá)則顯著增強(qiáng)。

3 討論

核基質(zhì)是真核細(xì)胞核內(nèi)的纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，不僅對(duì)于維持細(xì)胞核形態(tài)、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、RNA加工修飾、基因表達(dá)調(diào)控等方面有重要作用［5～7］，且還參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化與凋亡等生命活動(dòng)［8］。

本研究采用HMBA誘導(dǎo)人食管癌EC9706細(xì)胞分化，共發(fā)現(xiàn)15個(gè)差異表達(dá)的核基質(zhì)蛋白。其中NMP-5、8、12、13、14 為經(jīng) HMBA 誘導(dǎo)處理后新出現(xiàn)的蛋白質(zhì)，而NMP-7、11和15在EC9706細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)的蛋白誘導(dǎo)處理后明顯減弱，提示這些蛋白的表達(dá)與EC9706細(xì)胞的增殖及其惡性程度有重要關(guān)系。NMP-1、2、3、4、6、7、9 和 10 在 EC9706 細(xì)胞中表達(dá)較弱，在HMBA處理后細(xì)胞中其表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示這些蛋白的出現(xiàn)和表達(dá)增強(qiáng)對(duì)于EC9706細(xì)胞的分化及其惡性表型的逆轉(zhuǎn)起了重要作用。本研究證實(shí)人食管癌EC9706細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中伴有核基質(zhì)蛋白表達(dá)的差異;與腫瘤細(xì)胞增殖分化相關(guān)的特異性核基質(zhì)蛋白的存在，初步從分子水平印證了核基質(zhì)與癌細(xì)胞分化和逆轉(zhuǎn)的重要關(guān)系。進(jìn)一步分離純化和鑒定上述核基質(zhì)蛋白，深入研究其在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，對(duì)于揭示核基質(zhì)蛋白與細(xì)胞癌變和逆轉(zhuǎn)的關(guān)系，闡明細(xì)胞增殖分化的基因表達(dá)調(diào)控原理，均具有十分重要的意義［9，10］。

綜上所述，深入研究這些在誘導(dǎo)分化處理過程中發(fā)生變化的核基質(zhì)蛋白，不僅可為相關(guān)疾病的診斷及治療靶點(diǎn)提供重要的依據(jù)，亦可為腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化機(jī)理的研究提供重要的切入點(diǎn)。

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