李紅艷 羅 旭 張海峰

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱 150081)

分子標(biāo)記技術(shù)也稱DNA分子診斷技術(shù)，是基于研究DNA分子由于缺失、插入、易位、倒立、重排或由于存在長短與排列不一的重復(fù)序列等機制而產(chǎn)生的多態(tài)性。它反映生物個體或群體間在基因組上某種差異特征的DNA片段，與表型標(biāo)記相比，分子標(biāo)記具有以下優(yōu)越性：(1)直接以DNA的形式表現(xiàn)，在動植物體的各個組織，各發(fā)育時期均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達與否的問題；(2)數(shù)量極多，遍及整個基因組；(3)多態(tài)性高，自然存在著許多等位變異，不需專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料；(4)表現(xiàn)為“中性”，即不影響目標(biāo)性狀的表達，與不良性狀無必須連鎖；(5)許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，能夠鑒別純合基因型與雜合基因型，提供完整的遺傳信息[1]。分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展迅速，種類包括：限制性片斷長度多態(tài)(Restriction Fragment Length Polymorphism,簡稱RFLP)、隨機引物擴增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,簡稱RAPD)、擴增片段長度多態(tài)(Amplified Fragment Length Polymorphism，簡稱AFLP)、SSR/VNTR(簡單序列重復(fù)或微衛(wèi)星/數(shù)量可變串聯(lián)重復(fù)或小衛(wèi)星)、微衛(wèi)星引動的PCR(MP-PCR)、錨定的SSR-PCR、PCR擴增微衛(wèi)星位點等。

林木種質(zhì)資源是國家重要的基礎(chǔ)戰(zhàn)略資源，是林木良種選育的基礎(chǔ)。長期以來，林木種質(zhì)資源的評價、保存與利用工作十分薄弱，種質(zhì)資源的流失非常嚴(yán)重。我國雖然樹種資源豐富，但森林資源貧乏，大量具有特殊價值和利用潛力的樹種的遺傳資源及其有效群體逐漸減少，種質(zhì)資源的流失，不僅對林木良種選育工作造成很大損害，而且對整個森林生態(tài)安全已經(jīng)構(gòu)成威脅。利用分子標(biāo)記技術(shù)對種質(zhì)資源進行研究是一個新的學(xué)科方向，近年來分子標(biāo)記技術(shù)越來越多地應(yīng)用于松科植物種質(zhì)資源研究工作中。

1 物種鑒定及種間親緣關(guān)系分析

林木種子的真實性鑒定，一直是種苗生產(chǎn)、貿(mào)易中的突出問題。一些親緣關(guān)系較近的種，特別是松科中松屬及落葉松屬的某些種，其種子甚至幼苗的形態(tài)都非常相似，往往難以根據(jù)形態(tài)對其進行區(qū)分。另外，落葉松的一些雜交種往往集合了雙親的優(yōu)點，在種子園中這些雜交種和它們的親本種子很難鑒別，甚至生長幾年后也難以區(qū)分[2]。對于不同的物種，其基因組DNA所攜帶的遺傳信息必然有所不同，只不過親緣關(guān)系近的物種差異程度小，親緣關(guān)系遠的差異程度大。因此，DNA分子標(biāo)記被越來越多地用于物種鑒定和種間親緣關(guān)系分析。早在1992年，Bobola等[3～5]利用RFLP標(biāo)記技術(shù)對紅云杉和黑云杉進行了鑒別，雖然獲得的標(biāo)記不具有100%種的特異性，但通過細胞器和核基因組RFLP標(biāo)記的組合，可以對紅云杉和黑云杉進行可靠的區(qū)分。1995年，Perron等[6]對紅云杉和黑云杉進行研究，獲得了所有檢測樣本4個種一級水平上100%保守的RAPD標(biāo)記。1996年，Khasa[7]等用RAPD片段作為標(biāo)記區(qū)別云杉屬不同種白云杉、恩氏云杉以及它們的雜交種。1997年，F(xiàn)urman等[8]獲得了中美洲和墨西哥幾個松屬樹種一級水平上的特異的RAPD譜帶。1999年，Germano等[9]用SNPs做分類群鑒定，區(qū)別紅云杉、黑云杉、白云杉。2000年Scheepers等[10]用RAPD的方法鑒定落葉松和其雜種，得到了特異的RAPD條帶。2003年，Nkongolo等[11]從多脂松(Pinusresinosa)中分離了少量的微衛(wèi)星DNA引物，其中的一對引物產(chǎn)生了豐富的信息，可以用來鑒別松樹樹種。2004年，Achere等[12]根據(jù)葉綠體基因組父系遺傳，而線粒體基因組母本遺傳的特性，用PCR-RFLP的方法擴增了葉綠體基因組基因，通過酶切片斷的差異區(qū)分了日本落葉松和歐洲落葉松，結(jié)合線粒體基因特異片斷，區(qū)分落葉松的父本和母本；同年，我國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局也出版了用RAPD進行落葉松種子鑒定的實驗方法[13]。2005年，趙阿風(fēng)[14]用8對SSR引物的指紋組合建立了福建省五一林場馬尾松無性系測定林的DNA指紋圖譜，可以簡便有效地區(qū)分開全部供試的120個不同無性系。2006年，曲麗娜等[15]采用RAPD和ISSR分子標(biāo)記對興安落葉松、華北落葉松和長白落葉松進行不同物種的種間鑒別，得到鑒別三種落葉松苗木的3個RAPD引物，鑒別三種落葉松種子的3個RAPD引物和2個ISSR引物。2008年，張磊等[16]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對興安、長白和日本落葉松種間以及不同無性系進行了鑒別，從49條引物中篩選出13條ISSR引物可以對落葉松種間和無性系間進行鑒別，特異條帶個體的百分率為100%。2009年，郭樹杰[17]利用RAPD技術(shù)對陜西隴縣八渡林場油松種子園14個無性系進行鑒別，其中6個RAPD引物可有效對14個無性系進行分子鑒別。

2 群體遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性分析

遺傳多樣性泛指地球上所有生物的遺傳信息的總和，包括不同物種間以及物種內(nèi)的遺傳變異。狹義上遺傳多樣性通常指物種內(nèi)的不同種群內(nèi)不同個體間的遺傳變異[18]。它反映著一個物種適應(yīng)環(huán)境的能力及其被改造和利用的潛力。遺傳結(jié)構(gòu)就是遺傳變異或者基因和基因型在時間和空間上的分布式樣，它受突變、基因流、自然選擇和遺傳漂變的共同作用，同時還和物種的進化歷史和生物學(xué)特性有關(guān)[19]。遺傳多樣性是生物界幾十億年進化所產(chǎn)生的寶貴資源，是人類生存和社會生產(chǎn)發(fā)展的基礎(chǔ)。遺傳多樣性的研究為揭示生物分子進化、地理變異和物種形成提供了強有力的證據(jù)和方法，是保護人類賴以生存的種質(zhì)資源的基礎(chǔ)，是推動生命科學(xué)進步的重要工具。

在松科植物的遺傳多樣性研究中，以張恒慶等對涼水國家自然保護區(qū)天然紅松的研究報道較多。對天然紅松遺傳多樣性在時間尺度上變化的RAPD分析結(jié)果表明：紅松在時間尺度上的遺傳分化比空間尺度的低，涼水保護區(qū)內(nèi)的紅松遺傳多樣性在1581—1900年的時間段內(nèi)沒有太大的波動，齡級間遺傳多樣性分化不明顯，紅松遺傳多樣性主要存在于齡級內(nèi)[20，21]。對涼水、豐林國家自然保護區(qū)紅松居群遺傳多樣性的研究，無論采用RAPD標(biāo)記，還是ISSR標(biāo)記，結(jié)果均表明：紅松的遺傳多樣性涼水居群大于豐林居群。對比分析了這兩個天然紅松居群的遺傳多樣性變化，紅松種內(nèi)的遺傳變異主要存在于居群內(nèi)，居群內(nèi)存在一定的遺傳分化[22～25]。馮富娟等[26]利用ISSR技術(shù)分析了長白山不同海拔高度紅松的遺傳分化，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)的遺傳多樣性水平呈現(xiàn)隨海拔升高而降低的趨勢。長白山不同海拔高度紅松的變異主要來自群體內(nèi)，紅松之間的遺傳距離和垂直地理距離之間有明顯的正相關(guān)性。推測：紅松的垂直分布由低海拔向高海拔處擴散而形成的。楊傳平等[27]應(yīng)用ISSR技術(shù)，以俄羅斯的西伯利亞紅松不同地理分布區(qū)的19個種源為材料進行遺傳多樣性研究，結(jié)果表明：種源的平均多態(tài)位點比率為26.48%，具有高的遺傳多樣性，種源間存在一定程度的基因流動和遺傳分化。此外，張冬東[28]利用SRAP技術(shù)分析露水河林業(yè)局紅松種子園種源試驗林中24個種源的遺傳結(jié)構(gòu)，王洪梅[29]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了露水河種子園和天然紅松的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果均表明：群體的遺傳變異主要存在于種源(群體)內(nèi)。

馬尾松遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究方面，艾暢等[30]對福建五一，朱必鳳等[31]對廣東韶關(guān)，張薇等[32]對福建白砂，萬愛華等[33]對湖北京山，楊玉潔等[34]對湖南桂陽馬尾松種子園的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進行了分析，結(jié)果表明馬尾松種子園均具有較高的遺傳多樣性。李丹等[35]采用RAPD技術(shù)分析測定了3個馬尾松海拔梯度種群的分子遺傳特征，發(fā)現(xiàn)馬尾松種群中遺傳多樣性較高，種群間的分化程度較低，大部分變異存在于種群內(nèi)。劉愛萍[36]用RAPD和ISSR標(biāo)記對我國12個省(區(qū))馬尾松優(yōu)良種質(zhì)資源代表品種進行了親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析，多態(tài)性百分率分別為89.5%和88.9%。李志輝[37]等用ISSR標(biāo)記對廣西古蓬和浪水兩個種源區(qū)的馬尾松天然林5個群體共85份樣品進行遺傳多樣性分析，古蓬種源多態(tài)位點百分率為94.35%，浪水多態(tài)位點百分率為94.38%，表明馬尾松天然林群體內(nèi)遺傳多樣性水平高，個體間基因多樣性變異大。

油松是我國的特有樹種，從目前研究的有關(guān)資料來看，國外的研究報道甚少，國內(nèi)最近幾年對油松的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究的較多。2008年，李毳[38]利用RAPD和ISSR兩種分子標(biāo)記方法對山西5個天然油松群體進行了遺傳多樣性分析；周飛梅[39]等，利用RAPD分析了陜西地區(qū)油松天然群體的遺傳結(jié)構(gòu)；2009年，王磊[40]利用隨機微衛(wèi)星擴增多態(tài)性DNA(RMAPD)分子標(biāo)記技術(shù)，分析了油松12個天然居群245個個體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)；郝真真[41]采用ISSR分子標(biāo)記方法，研究了油松整個分布區(qū)的13個代表種種群遺傳多樣性和空間遺傳結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果均表明：種群間有一定程度的變異，但大部分變異存在于種群內(nèi)。

對于松科其他植物，1993年，Strauss等[42]利用RAPD技術(shù)分析了日本落葉松的遺傳多樣性，Hong等[43]分析了輻射松、刺果松和瘤果松線粒體DNA的RFLP遺傳多樣性。1995年，Hamelin等[44]應(yīng)用RAPD標(biāo)記研究了美國白松22個群體的核DNA的遺傳變異, Vicario等[45]采用12個隨機引物對7個冷杉群體進行RAPD標(biāo)記的遺傳多樣性研究。1996年，Szmidt等[46]對歐洲赤松的兩個群體進行了RAPD分析，Bobola等[47]分析了紅云杉和黑云杉基因組rDNA的 RFLP遺傳多樣性。1998年，Echt等[48]利用SSR技術(shù)分析了脂松的遺傳多樣性。1999年，Lerceteau和Szmodt[49]利用AFLP技術(shù)研究了樟子松的遺傳多樣性；Rajora[50]基于RAPD標(biāo)記分析了來自天然林、天然次生林、人工林和樹木改良選擇林共420株白云杉的遺傳結(jié)構(gòu)。2000年，Collignon and Favre[51]分析了挪威云杉的RAPD遺傳多樣性；Karhu等[52]分析了黑松的RAPD及STR遺傳多樣性；易能君等[53]分析了濕地松抗病種子園的遺傳多樣性。2001年，Mariette等[54]利用AFLP和SSR技術(shù)對23個種群的海岸松進行遺傳多樣性研究；Vikram等[55]用AFLP標(biāo)記研究嚴(yán)酷的氣候條件和微生態(tài)環(huán)境對挪威云杉群體遺傳結(jié)構(gòu)的影響。2002年，Kraj[56]基于RAPD多態(tài)性分析原產(chǎn)于波蘭的挪威云杉群體的遺傳變異。唐娟娟等[57]利用RAPD分析了黃山松10個家系的遺傳多樣性。2003年，Diaz and Ferrer[58]用RGAP標(biāo)記分析了卵果松群體遺傳變異，張志勇和李德銖[59]分析了五針白皮松的RAPD遺傳多樣性。2004年，王秋玉等[60]對紅皮云杉地理種源遺傳多樣性進行了RAPD分析，張新葉等[61]利用cpSSR分子標(biāo)記對日本國內(nèi)的7個日本落葉松群體遺傳結(jié)構(gòu)進行了研究。2005年，稅珺等[62]對火炬松19個原生種源和國內(nèi)早期引進的5個群體進行RAPD遺傳多樣性研究。2006年，周志強等[63]研究了大興安嶺北段天然樟子松林遺傳多樣性，那冬晨等[64]利用ISSR標(biāo)記對17個興安落葉松種源170個個體遺傳多樣性進行了分析。2007年，劉占林和楊雪[65]研究了巴山松(P.henryiMast.)、黃山松、油松、馬尾松以及云南松(P.yunnanensisFranch.)5種松樹的遺傳多樣性。

3 分子遺傳圖譜構(gòu)建

遺傳圖譜(genetic map)又稱連鎖圖(linkage map)，是以具有多態(tài)性的遺傳標(biāo)記為路標(biāo)，以兩個位點的交換率為圖距的圖譜，它包括將基因定位于某一特定染色體上，以及測定基因在染色體上線性排列的順序和距離。遺傳圖譜既是遺傳研究的重要內(nèi)容，又是種質(zhì)資源、育種及分子克隆等許多應(yīng)用研究的理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

分子標(biāo)記從一產(chǎn)生就在松科植物遺傳連鎖圖譜構(gòu)建中得到了廣泛的應(yīng)用和認可。據(jù)統(tǒng)計顯示，迄今國內(nèi)外利用RAPD、RFLP、AFLP和微衛(wèi)星標(biāo)記對松科植物已經(jīng)構(gòu)建了20多張遺傳連鎖圖譜。Tulsieram等[66]最早利用RAPD標(biāo)記構(gòu)建了白云杉的遺傳圖譜，用相同的技術(shù)，又相繼建成了多種松科植物的遺傳圖譜，如濕地松、長葉松、糖松、海岸松、歐洲赤松、土耳其松、南歐海松、北美喬松、馬尾松、挪威云杉等[67～77]。

隨著RFLP和AFLP標(biāo)記技術(shù)的開發(fā)，RFLP和AFLP標(biāo)記技術(shù)也被用于松科植物遺傳連鎖圖譜構(gòu)建中。1994年，Devey等[69]首先構(gòu)建了火炬松的RFLP遺傳圖譜；之后，Remington等[78]利用AFLP標(biāo)記技術(shù)又構(gòu)建了一張較為完整的火炬松的遺傳連鎖圖譜，建立起來的完全連鎖圖譜可將現(xiàn)存的火炬松圖譜合并成高密度圖譜；1998年Travis等[79]構(gòu)建了赤松的AFLP遺傳圖譜；2003年Yin等[80]構(gòu)建了樟子松的AFLP遺傳圖譜。此外，Devey等[81]用RAPD、RFLP和SSR標(biāo)記構(gòu)建輻射松的遺傳連鎖圖譜，Costa等人[82]利用AFLP、RAPD和蛋白質(zhì)標(biāo)記構(gòu)建了含有239個AFLP標(biāo)記、127個RAPD標(biāo)記和31個分離蛋白的一張長葉松遺傳連鎖圖譜。

比較基因組研究就是利用共同的分子標(biāo)記在相關(guān)物種中進行物理或遺傳作圖，比較這些標(biāo)記在不同物種基因組中的分布情況，揭示染色體片段上同線性或共線性的存在，從而對不同物種的基因組結(jié)構(gòu)及基因組進化歷程進行精細分析。比較基因組作圖需要用相同的標(biāo)記構(gòu)建不同種的遺傳連鎖圖，在松科植物中比較基因組作圖也取得了一定的進展，Devey等[83]用RFLP和SSR標(biāo)記構(gòu)建了火炬松和輻射松的比較遺傳圖譜；Brown等[84]構(gòu)建了火炬松與濕地松的RFLP及EST的比較遺傳圖譜；Komulainen等[85]用EST、AFLP及SSR標(biāo)記構(gòu)建了歐洲赤松與火炬松的比較遺傳圖譜。Mitchell等[86]將兩張不相關(guān)的三代群體火炬松連鎖圖整合成一張較完整的連鎖圖，整合后的火炬松遺傳連鎖圖含有357個標(biāo)記，分屬于12個連鎖群，覆蓋火炬松基因組約1 300cm，整合后的這張連鎖圖可作為火炬松的一張參考遺傳連鎖圖，為研究松科植物結(jié)構(gòu)和進化關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

4 問題與展望

綜上所述，分子標(biāo)記在松科植物種質(zhì)資源中已有較多的應(yīng)用，取得了相應(yīng)的研究成果。但從報道的情況看還存在以下問題：(1)目前應(yīng)用于松科植物的分子標(biāo)記中，RAPD技術(shù)用得較多，其他分子標(biāo)記技術(shù)沒有被廣泛地應(yīng)用，尤其是一些較新的分子標(biāo)記技術(shù)在松科植物中沒有應(yīng)用；(2)已構(gòu)建的松科植物遺傳圖譜的標(biāo)記大部分小于300個，密度較低，不能對簡單及復(fù)雜的經(jīng)濟性狀進行精確定位；(3)我國在松科植物上這方面的研究還做得很少，研究的廣泛與系統(tǒng)性以及研究的層次與深入的程度上，與國際水平差距較大。因此，在今后的研究中，應(yīng)該加強國際國內(nèi)交流合作，積極主動地開展這方面的基礎(chǔ)性研究，針對松科植物本身的生物學(xué)特性和生產(chǎn)中的突出問題，發(fā)展適合松科植物自身特點的理論和分析方法，開展多種分子標(biāo)記的研究，提高標(biāo)記的多態(tài)性和穩(wěn)定性，構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖譜、定位重要生長性狀和經(jīng)濟性狀，通過有效的選擇手段，從古老品種或野生種中鑒定出一些優(yōu)良性狀基因，并將這些優(yōu)良遺傳物質(zhì)引入栽培品種中，拓寬松科植物主要栽培樹種的遺傳基礎(chǔ)，加速松科植物遺傳改良的進程，為種質(zhì)資源的保護及開發(fā)利用提供極為重要的科學(xué)理論依據(jù)和良好的技術(shù)條件。

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