陳俊材 王 威 王之盛

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，雅安 625014)

利用體外法研究納米氧化鋅的添加對瘤胃發(fā)酵的影響

陳俊材 王 威 王之盛*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，雅安 625014)

為探究飼糧添加納米氧化鋅對瘤胃發(fā)酵的影響，本試驗通過體外發(fā)酵法研究了納米氧化鋅不同添加水平(0、50、100、200、400 mg/kg，干物質(zhì)基礎(chǔ))對瘤胃培養(yǎng)液 pH、氨態(tài)氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)以及底物有機物發(fā)酵率(FOM)的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)條件下，納米氧化鋅的添加對培養(yǎng)液pH無顯著影響(P＞0.05);與對照組相比，添加100和200 mg/kg DM的納米氧化鋅在6和12 h顯著提高了FOM和MCP及VFA濃度(P＜0.05)，降低了NH3-N濃度和乙酸/丙酸的比例(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，納米氧化鋅的添加在體外培養(yǎng)前期(6～12 h)能夠有效地促進(jìn)瘤胃微生物對飼糧有機物的發(fā)酵，增加MCP產(chǎn)量，提高瘤胃發(fā)酵的能量利用效率。

納米氧化鋅;瘤胃發(fā)酵;體外法

鋅是動物體內(nèi)一種重要的微量元素，參與了動物體內(nèi)多種酶的組成，并且與機體碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝密切相關(guān)。鋅的攝入不足會影響動物的生長發(fā)育，引起代謝紊亂及生產(chǎn)性能下降。Nunnery等［1］發(fā)現(xiàn)飼糧中缺鋅會對肥育期肉牛的料肉比產(chǎn)生負(fù)面影響;姚軍虎等［2］研究發(fā)現(xiàn)青年奶牛飼糧中補鋅可促進(jìn)其生長發(fā)育，提高飼料轉(zhuǎn)化效率。而對于反芻動物而言，鋅的營養(yǎng)意義不僅限于動物機體本身，對于瘤胃內(nèi)環(huán)境也有重要的作用。1958年Hubbert等［3］證明鋅是瘤胃微生物生長的必需微量元素之一;有研究表明，高劑量鋅的添加對瘤胃發(fā)酵和瘤胃內(nèi)纖毛蟲數(shù)量有所影響［4］;Bateman 等［5］則指出，鋅能夠改變瘤胃發(fā)酵模式，降低乙酸比例。

納米氧化鋅是一種新型的鋅源，與普通鋅源相比具有吸收快、生物學(xué)利用率高、抗氧化性強等特點。目前納米氧化鋅在單胃動物應(yīng)用中已有初步研究，研究結(jié)果表明納米氧化鋅具有良好的促生長和抗氧化作用，作用效果優(yōu)于飼料級氧化鋅［6－7］。但納米氧化鋅在反芻動物上的研究尚未見報道。鑒于此，本試驗利用體外發(fā)酵法研究添加不同水平的納米氧化鋅對瘤胃發(fā)酵的影響，為今后納米氧化鋅在反芻動物中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

納米氧化鋅平均粒徑20 nm。由廈門大學(xué)化學(xué)系固體表面物理化學(xué)國家重點實驗室通過均勻沉淀法制備，并通過X射線衍射儀、透射電鏡、靜態(tài)氮氣吸附法進(jìn)行納米特性表征測定。經(jīng)原子吸收儀測定該納米氧化鋅樣品的鋅含量為77.32%。

1.2 試驗動物及瘤胃液的采集

選用3頭體況良好、平均體重為(300±10)kg、安裝有永久性瘤胃瘺管的宣漢黃牛作為瘤胃液供體動物。飼糧精粗比為4∶6，每日08:00和16:00等量飼喂，自由飲水。在試驗當(dāng)天晨飼前抽取瘤胃液，4層紗布過濾至預(yù)熱處理后的收集瓶，39℃水浴保溫，充入CO2厭氧備用。

1.3 試驗設(shè)計

采用單因素5水平試驗設(shè)計，發(fā)酵底物干物質(zhì)基礎(chǔ)上5個納米氧化鋅添加水平分別為0(對照組)、50、100、200、400 mg/kg，每個水平設(shè) 4 個時間點，每個時間點設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)1支發(fā)酵管。

1.4 體外培養(yǎng)

體外培養(yǎng)參照Menke等［8］的方法進(jìn)行，將配制好的瘤胃緩沖液與瘤胃液按2∶1的比例混合制成培養(yǎng)液，通入CO2并且放入39℃的水浴搖床上等待培養(yǎng)。準(zhǔn)確稱取發(fā)酵底物500 mg(干物質(zhì)基礎(chǔ)，稻草粉和玉米粉各250 mg，實測鋅含量為11.17 mg/kg)，置于發(fā)酵管底部，加入不同水平的納米氧化鋅，最后加入始終用CO2氣體飽和的培養(yǎng)液30 m L，置于39℃的水浴搖床中培養(yǎng)。

1.5 樣品采集

分別在體外培養(yǎng)6、12、24、48 h后終止發(fā)酵，收集培養(yǎng)液，4層紗布過濾，即時測定pH，隨后于－20℃凍存并在1周內(nèi)完成氨氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的測定。將過濾后的發(fā)酵殘留物沖洗過后放入65℃烘箱烘干48 h，待測有機物(OM)。

1.6 測定指標(biāo)及方法

pH使用雷磁PHS－3D型pH計測定;NH3-N濃度的測定參照馮宗慈等［9］的方法進(jìn)行;MCP采用 Zinn 等［10］的方法建立，經(jīng) Makkar等［11］改進(jìn)的嘌呤法進(jìn)行測定;OM發(fā)酵率測定參照楊勝［12］的方法進(jìn)行。

VFA采用瓦里安CP－3800 GC氣相色譜儀進(jìn)行測定，色譜柱為長2 000 mm、內(nèi)徑3 mm的填充柱;柱溫140℃，離子化室溫230℃;載氣(N2)流速為45 m L/m in，氫氣流速為35 m L/m in，空氣流速為250 m L/m in;靈敏度為107，衰減為4，進(jìn)樣量為0.6 μL。

OM發(fā)酵率(FOM，%)=100×(發(fā)酵前OM量－發(fā)酵后OM量)/發(fā)酵前OM量。

1.7 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件中的ANOVA過程進(jìn)行方差分析，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。

2 結(jié)果

2.1 納米氧化鋅對培養(yǎng)液pH的影響

由表1可知，各個試驗組pH水平處于5.82～6.63，屬于正常瘤胃pH范圍。隨著納米氧化鋅添加水平的升高，各時間點瘤胃培養(yǎng)液pH呈現(xiàn)下降趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)。而在同一添加水平下，各個試驗組培養(yǎng)液pH均隨培養(yǎng)時間延長出現(xiàn)顯著下降(P＜0.05)。

表1 不同納米氧化鋅添加水平對各時間點培養(yǎng)液pH的影響Table 1 Effect of Nano-ZnO supplementation level on pH at different time points in vitro

2.2 納米氧化鋅對培養(yǎng)液NH 3-N濃度和MCP合成的影響

各個試驗組NH3-N濃度隨著時間的變化均表現(xiàn)出相似的規(guī)律:隨著發(fā)酵時間的延長，NH3-N濃度逐漸升高;在6～12 h內(nèi)，上升幅度較小，12 h后出現(xiàn)大幅度上升，見表2。同一時間點，在納米氧化鋅添加水平在0～200 mg/kg時，隨著納米氧化鋅添加水平的升高NH3-N濃度呈現(xiàn)降低趨勢;當(dāng)納米氧化鋅添加水平為400 mg/kg時，NH3-N濃度出現(xiàn)升高。并且在6 h時，400 mg/kg添加水平試驗組與對照組的差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。

由表3可知，納米氧化鋅的添加明顯提高了MCP的合成量，且與對照組相比，納米氧化鋅添加水平為200 mg/kg試驗組在6和12 h時對MCP合成量的提高均達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，提高量達(dá)15%以上;當(dāng)添加量達(dá)到400 mg/kg時，MCP合成量開始出現(xiàn)下降。在相同添加水平下，隨著培養(yǎng)時間的增加，MCP合成量呈現(xiàn)先升高后降低的規(guī)律性變化，各試驗組的變化規(guī)律相似。

表2 不同納米氧化鋅添加水平對各時間點培養(yǎng)液NH 3-N濃度的影響Table 2 Effect of Nano-ZnO supplementation level on NH3-N concentration at different time points in vitro mg/dL

表3 不同納米氧化鋅添加水平對各時間點培養(yǎng)液M CP產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of Nano-ZnO supplementation level on MCP yield at different time points in vitro mg/m L

2.3 納米氧化鋅對底物有機物發(fā)酵率的影響

在6 h，納米氧化鋅添加水平為0～200 mg/kg時，底物有機物發(fā)酵率隨著添加量的增加從6.19% 上 升 到 15.48%(P＜ 0.05)，并 且 在200 mg/kg時達(dá)到最大值;而當(dāng)添加量達(dá)到400 mg/kg時，底物有機物發(fā)酵率出現(xiàn)了下降，見表4。12、24、48 h時不同水平納米氧化鋅的添加，底物有機物發(fā)酵率呈現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，但是沒有達(dá)到差異顯著水平(P＞0.05)。

2.4 納米氧化鋅對培養(yǎng)液VFA濃度的影響

隨著納米氧化鋅添加水平的升高，各時間點培養(yǎng)液的總VFA(TVFA)、乙酸、丙酸和丁酸濃度均呈現(xiàn)先升高后降低的規(guī)律性變化;并且在6 h時，各水平添加納米氧化鋅均顯著提高了乙酸、丙酸、丁酸以及TVFA的濃度(P＜0.05)，其余各培養(yǎng)時間點雖然VFA濃度都有上升的趨勢，但均未達(dá)到差異顯著水平(P＞0.05)，見表5。在同一納米氧化鋅添加水平下，TVFA、乙酸、丙酸和丁酸濃度隨培養(yǎng)時間的延長均呈現(xiàn)逐漸上升的變化規(guī)律，在培養(yǎng)前期即12 h前升高幅度較大，而12 h后趨于平穩(wěn)，且各試驗組變化趨勢相似。

同時從表5還可以得出，在培養(yǎng)前期納米氧化鋅的添加顯著降低了培養(yǎng)液乙酸/丙酸的比值(P＜0.05)，在添加量為200 mg/kg時乙酸/丙酸的比值達(dá)到最低。

表4 不同納米氧化鋅添加水平對各時間點底物有機物發(fā)酵率的影響Table 4 Effect of Nano-ZnO supplementation level on the fermentation of organic matter substrates at different time points in vitro %

表5 不同納米氧化鋅添加水平對各時間點培養(yǎng)液中VFA濃度的影響Table 5 Effect of Nano-ZnO supplementation level on VFA concentration at different time points in vitro

3 討論

3.1 不同水平納米氧化鋅對培養(yǎng)液pH的影響

pH是反映瘤胃內(nèi)部環(huán)境與發(fā)酵水平的一項綜合性指標(biāo)，它受飼糧類型、唾液分泌、瘤胃代謝產(chǎn)物的吸收與外排等多種因素的影響。通常認(rèn)為正常的瘤胃pH變化范圍為6～7，而當(dāng)pH低于6時，纖維分解菌和原蟲數(shù)量將減少，甚至消失［13］。Calsam iglia等［14］也研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng) pH 低于 5.7時，飼糧中纖維素和蛋白質(zhì)的降解率就會降低。在本試驗中除48 h時間點外，各試驗組pH均大于6，隨著納米氧化鋅添加水平的升高有降低的趨勢，但是相互之間差異不顯著，這可能是由于納米氧化鋅促進(jìn)微生物發(fā)酵產(chǎn)生更多的VFA而導(dǎo)致pH降低，但同時由于人工瘤胃緩沖液較強的緩沖作用導(dǎo)致未達(dá)到差異顯著水平。由于本次試驗采用不連續(xù)體外發(fā)酵，不能及時排除代謝產(chǎn)物以及VFA的大量沉積，所以各試驗組培養(yǎng)液pH隨培養(yǎng)時間的延長而出現(xiàn)顯著下降(P＜0.05)，在48 h時下降至6以下。這也提示我們，作為不連續(xù)體外發(fā)酵裝置，培養(yǎng)時間不宜超過24 h，否則瘤胃微生物生長受到抑制，甚至出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象，影響指標(biāo)的測定。

3.2 不同水平納米氧化鋅對培養(yǎng)液NH3-N濃度和MCP合成的影響

NH3-N是瘤胃氮代謝的一個中間產(chǎn)物，是瘤胃微生物生長的重要氮源，由于體外培養(yǎng)沒有瘤胃壁對NH3-N的吸收、分泌等的影響，所以它的濃度主要取決于2個方面:一方面是瘤胃微生物降解飼糧中的含氮化合物為NH3-N的能力，另一方面是瘤胃微生物利用NH3-N合成MCP的能力。Arelovich等［15］研究發(fā)現(xiàn)，鋅的添加能夠抑制瘤胃內(nèi)脲酶活性，加鋅后2 h使瘤胃NH3-N濃度顯著下降。而在本試驗中，在培養(yǎng)前期，當(dāng)納米氧化鋅的添加量在200 mg/kg以下時明顯地降低了培養(yǎng)液的NH3-N濃度，這可能還與瘤胃微生物對NH3-N利用率的提高有關(guān):因為從本試驗納米氧化鋅對MCP合成影響的試驗結(jié)果來看，在培養(yǎng)前期納米氧化鋅顯著提高了MCP的合成(P＜0.05);并且在6、12和24 h各個試驗組的NH3-N濃度也都處于最佳濃度范圍 6.3 ～ 27.5 mg/dL［16］，所以納米氧化鋅是促進(jìn)了瘤胃微生物的生長，提高了瘤胃微生物對NH3-N的利用率，從而NH3-N濃度出現(xiàn)下降。這與前人報道飼糧中添加鋅能夠減少瘤胃氨的濃度、促進(jìn) MCP的合成［17］、提高瘤胃NH3-N 利用效率［18］的結(jié)論一致。Kennedy 等［19］推測鋅可能在微生物附著在飼料表面的過程中扮演著重要角色，這也可能是鋅增加瘤胃微生物蛋白產(chǎn)量的原因之一，但還需要進(jìn)一步的研究。而當(dāng)納米氧化鋅添加水平達(dá)到400 mg/kg時，NH3-N濃度出現(xiàn)上升，MCP合成量開始下降，說明高濃度的納米氧化鋅可能抑制了瘤胃微生物生長，從而使NH3-N的吸收與利用效率開始降低，NH3-N開始積累導(dǎo)致其濃度上升。

而從同一添加水平不同培養(yǎng)時間來看，在培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液NH3-N濃度出現(xiàn)大幅上升，MCP合成量也開始出現(xiàn)下降。這可能是由于在體外培養(yǎng)條件下，瘤胃微生物的增殖主要在前12 h，這個時期MCP合成量增加，NH3-N的產(chǎn)生與利用也處于一個相對平衡的狀態(tài);24 h以后可能由于發(fā)酵管和代謝產(chǎn)物積累的限制，微生物增殖進(jìn)入平臺期并開始出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。張吉鹍等［20］也發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)條件下，MCP產(chǎn)量在24 h后開始下降。NH3-N的濃度在培養(yǎng)后期上升則主要可能是一方面由于瘤胃微生物對NH3-N的利用率下降，引起NH3-N的累積;另一方面由于細(xì)菌溶菌或者纖毛蟲的吞噬作用而釋放的［21］。這也可能是納米氧化鋅的添加在培養(yǎng)24 h后沒有顯著效果的原因:納米氧化鋅能夠在前期促進(jìn)瘤胃微生物迅速增殖，產(chǎn)生更多的VFA和MCP，而微生物在進(jìn)入增殖的平臺期后無法繼續(xù)增殖，進(jìn)而與對照組差異逐漸減小。

3.3 不同水平納米氧化鋅對底物有機物發(fā)酵率和培養(yǎng)液VFA濃度的影響

有機物發(fā)酵率與瘤胃微生物的活動密切相關(guān)，鋅的添加能夠通過促進(jìn)瘤胃微生物的生長，從而提高飼糧有機物發(fā)酵率。Bateman等［22］報道，500 mg/kg的鋅的添加能夠增加尼龍袋中豆餅蛋白質(zhì)的消失速率。王峰等［23］發(fā)現(xiàn)飼糧中添加鋅在6和48 h時明顯提高了尼龍袋中玉米有機物的降解率。本試驗結(jié)果也表明，納米氧化鋅的添加顯著地提高了6和12 h底物有機物的發(fā)酵率(P＜0.05)，這與采用普通無機鋅試驗結(jié)果一致。而Froetschel等［4］發(fā)現(xiàn)1 142 mg/kg鋅的添加對飼糧有機物消化率沒有影響(P＞0.05)，這可能與其鋅的過量添加有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅的添加在6 h時顯著提高了培養(yǎng)液 VFA濃度，在12、24、48 h有提高VFA濃度的趨勢，并且在試驗全期明顯降低乙酸/丙酸的比例。而Bateman等［17］發(fā)現(xiàn)硫酸鋅的補飼使乙酸比例下降，但是對TVFA的濃度沒有影響，Arelovich等［18］的研究也表明飼糧中添加氯化鋅，對TVFA濃度沒有顯著影響。這與本試驗結(jié)果略有不同，可能是因為納米氧化鋅同時具備氧化鋅和納米材料雙重特性，納米氧化鋅具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)等納米材料特殊的性質(zhì)，有極強的自由擴(kuò)散能力，是普通氧化鋅的105～109倍［24］，有著比普通鋅源更高的生物學(xué)利用效率。

VFA是反芻動物的主要能量來源，也是瘤胃微生物增殖的主要碳架來源，并且丙酸轉(zhuǎn)化成能量的效率要高于乙酸和丁酸［25］，所以納米氧化鋅的添加降低了乙酸/丙酸的比例，從而提高了瘤胃發(fā)酵的能量利用效率。Arelovich等［15］推測鋅對瘤胃微生物的作用方式可能與離子載體類似，在瘤胃中通過抑制某些革蘭氏陰性菌及瘤胃產(chǎn)氫微生物的活動提高丙酸的比例。本試驗結(jié)果表明納米氧化鋅也可能引起了瘤胃微生物區(qū)系的變化，從而對VFA的生成產(chǎn)生影響，這還有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

在本試驗體外培養(yǎng)條件下，添加納米氧化鋅在培養(yǎng)前期(6～12 h)可以促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，提高有機物發(fā)酵率、MCP產(chǎn)量和VFA濃度，降低乙酸/丙酸及NH3-N濃度;其中以200 mg/kg添加水平效果最佳。

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*Corresponding author，professor，E-mail:wangzs007@yahoo.com.cn

(編輯 趙天章)

Effect of Nano-Zinc Oxide Supp lem entation on Rum en Ferm entationin vitro

CHEN Juncai WANG Wei WANG Zhisheng*
(Institute of Animal Nutrition，Sichuan Agricultural University，Key Laboratory for Animal Disease-resistance Nutrition of China Ministry of Education，Ya’an625014，China)

This study was carried out to investigate the effectof nano-zinc oxide supplementation on rumen fermentationin vitro.Five levels of nano-zinc oxide supplementation were 0，50，100，200，400 mg/kg of DM，respectively.Culturemediumin vitrowas sampled to determ ine pH，ammonia nitrogen(NH3-N)，m icrobial crud protein(MCP)，volatile fatty acids(VFA)and fermentation of organic matter.Results from this study showed that pH was not affected by adding different levels of nano-zinc oxide(P＞0.05).The concentration of VFA and MCP production and the fermentation of organic matter were significantly increased(P＜0.05)，while the concentration of ammonia nitrogen and the ratio of acetate to propionate were significantly decreased(P＜0.05)with the supplementation levels of 100 and 200 mg/kg of nano-zinc oxide at the 6thand 12thhour of incubationin vitro.In conclusion，the supplementation of nano-zinc oxide can improve the growth of rum inalm icroorganisms，increase the rum inalm icrobial protein synthesis，and raise the energy utilization efficiency in early phase(6 to 12 h)of incubationin vitro.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(8):1415-1421］

nano-zinc oxide;rumen fermentation;in vitro

S816.72

A

1006-267X(2011)08-1415-07

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.08.022

2011－03－02

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(肉牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項經(jīng)費資助(項目編號:CARS-38)

陳俊材(1987—)，男，四川成都人，碩士研究生，從事反芻動物營養(yǎng)與飼料的研究。E-mail:cjc1949@163.com

*通訊作者:王之盛，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:wangzs007@yahoo.com.cn