劉鐵梅，劉宗才，李丹丹，高美娟，張 琨，闞云超，李春奇

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450002;2.南陽師范學(xué)院河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點實驗室，河南南陽473061)

逆境脅迫是作物生長和產(chǎn)量提高的重要限制性因素之一.水資源匱乏造成的干旱是糧食生產(chǎn)中突出的問題.中國的耕地約800萬hm2有不同程度的鹽漬化，也成為提高糧食產(chǎn)量的限制因素［1］.玉米是中國重要的糧食作物，也是對鹽和干旱脅迫較敏感的植物，深入開展玉米的抗逆境脅迫機(jī)制研究，不僅對探索植物抗性的分子機(jī)制有重要的理論意義，而且對提高玉米產(chǎn)量也有重要的應(yīng)用價值.

非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)不編碼蛋白質(zhì)的RNA的總稱，目前在 http://www.noncode.org/index.htm 網(wǎng)站公布的數(shù)據(jù)中，初步統(tǒng)計出的非編碼RNA序列大概有212，527條，涵蓋861個物種，包括了病毒和類病毒等物種.這些非編碼RNA通過各種各樣的方式，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上對靶基因進(jìn)行調(diào)控，參與到生物生長發(fā)育過程中［2］.目前，研究最多的是microRNA，這些小分子RNA通過與靶基因互補(bǔ)配對等方式造成靶基因降解或翻譯抑制來調(diào)控靶基因的表達(dá).如在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的小分子 RNA miR160，它能夠通過調(diào)控 ARF10，ARF16，ARF17 基因的表達(dá)參與到生長激素信號傳導(dǎo)過程中［3，4］;研究發(fā)現(xiàn)，植物在受到逆境脅迫時，會誘導(dǎo)或抑制體內(nèi)某些非編碼RNA的表達(dá)來應(yīng)對脅迫，JIAN等［5］發(fā)現(xiàn)擬南芥在受寒害脅迫時，miR319c會被大量誘導(dǎo)表達(dá)，而 miR393，miR395，miR397b和 miR402 的表達(dá)能夠受到干旱或鹽分脅迫的影響;同時，過表達(dá)植物體內(nèi)存在的某些小分子RNA也會使植物產(chǎn)生一系列的生理生化反應(yīng).如過表達(dá)miR398會導(dǎo)致Cu/Zn超氧化物歧化酶CSD1和CSD2的mRNA生成減少;反之，過表達(dá)抗miR398的CSD2能夠提高植物對強(qiáng)光、重金屬等逆境的抗性，說明miR398在植物抗強(qiáng)光和重金屬脅迫過程中發(fā)揮著負(fù)向的調(diào)控作用［6］.除了這些小分子ncRNA，生物體內(nèi)還存在著為數(shù)眾多的長片段ncRNA.而且隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)這些長片段ncRNA在生物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著更廣泛的調(diào)控作用.如最近在玉米中鑒定出1種花粉特異性表達(dá)的長片段ncRNA Zm-401，能夠參與小孢子和花粉壁的形成.抑制或者過表達(dá)該ncRNA基因都會導(dǎo)致玉米小孢子空癟、變形，無內(nèi)容物，絨氈層出現(xiàn)退化延遲，使花粉形態(tài)異常，甚至導(dǎo)致雄性不育［7］.在前期實驗的基礎(chǔ)上，對篩選到的1個外顯子起源的長片段ncRNA在干旱和鹽脅迫條件下的表達(dá)情況進(jìn)行了初步研究，以期從非編碼RNA的角度探索植物響應(yīng)逆境脅迫的分子調(diào)控機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試玉米品種為Ch7-2，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供.

1.2 玉米培養(yǎng)及取樣方法

玉米種子用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%HgCl2消毒5 min，蒸餾水沖洗4次，28℃暗處浸種12 h，暗處催芽48 h，移至1×Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)至3葉期(溫度28℃，濕度70%，光照/黑暗時間為14 h/10 h)，分別用20%PEG6000 處理 1，2，6 h;100 μmol·L-1ABA處理3，6，24 h;150 mmol·L-1NaCl處理 1，3，6，12，24，48 h;未處理的幼苗作對照，取玉米根，用DEPC水沖洗，吸水紙吸干后于液氮中保存?zhèn)溆?

1.3 試劑及儀器

1.3.1 試劑 PEG6000(Ameresco)，ABA(Sigma)，NaCl(Sigma)，Trizol(Invitrogen)，Northern Blot相關(guān)試劑購自Roche公司.

1.3.2 儀器 電泳儀(美國Bio-rad)，半干轉(zhuǎn)膜儀(美國 Bio-rad)，紫外交聯(lián)儀(法國，BLX-E254)，雜交爐(Thermo-Election)，低溫離心機(jī)(德國，Eppendorf)，凝膠成像系統(tǒng)(美國，Bio-rad)，PCR 儀(美國，MJ)

1.4 試驗方法

1.4.1 玉米根總RNA提取 Trizol法提取玉米根的總RNA.

1.4.2 半定量RT-PCR 通過查閱文獻(xiàn)資料，確定玉米的鹽脅迫、干旱脅迫和ABA脅迫的響應(yīng)基因:DREB2A(GenBank:AB218833.1)［8］，dbf1(Gen-Bank:AF493800.1)［9］，dhn1(NCBI Reference Sequence:NM_001111949.1)［9，10］.取不同處理玉米根的總RNA 2μg，按照Promega公司AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA第1鏈的合成，PCR引物如表1所示.

表1 半定量RT-PCR所用引物Table1 Primer sets for Semi-quantitative RT-PCR

1.4.3 Northern雜交 根據(jù)實驗室前期試驗結(jié)果得到在玉米根中表達(dá)的非編碼RNA Zm-1701;克隆入pGEM-4Z載體，體外轉(zhuǎn)錄合成RNA探針(地高辛標(biāo)記).取各個處理時間點的玉米根總RNA 2μg，6% 變性PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至帶正電的尼龍膜上，68℃雜交過夜，X光片采集雜交信號.

2 結(jié)果與分析

2.1 Zm-1701的發(fā)現(xiàn)及序列分析

在構(gòu)建玉米非編碼RNA cDNA文庫的過程中，發(fā)現(xiàn)1個由基因GRMZM2G555972外顯子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的ncRNA Zm-1701，經(jīng)Northern驗證后確定該RNA確實為真實存在的非編碼RNA，而不是mRNA降解產(chǎn)物.Zm-1701長162 nt，位于玉米第9條染色體上，其宿主基因 GRMZM2G555972，全長1 011 bp，編碼1個58 aa的功能未知蛋白，具體結(jié)構(gòu)特征還不清楚(見Maizesequence.org).用mfold對Zm-1701的2級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖1所示，該RNA 2級結(jié)構(gòu)接近1個H/ACA box snoRNA，但是進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Zm-1701不具有典型的H box和ACA box，且在玉米中沒有明顯的靶標(biāo)，不能指導(dǎo)rRNA，snRNA或tRNA的假尿嘧啶化修飾，所以屬于不能歸類的 ncRNA.其宿主基因GRMZM2G555972編碼玉米中1個未知的蛋白，且基因內(nèi)部存在1個Ac轉(zhuǎn)座子插入位點，位于Zm-1701基因上游.

圖1 Zm-1701的2級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 Putative secondary structure of Zm-1701

2.2 Zm-1701在3種脅迫條件下的表達(dá)

玉米中存在著大量可移動的遺傳元件—轉(zhuǎn)座子Ac(Activator)，一定的脅迫條件可以激活植物基因組中本來處于休眠狀態(tài)的轉(zhuǎn)座子，激活的轉(zhuǎn)座子會導(dǎo)致基因組和生物性狀的不穩(wěn)定，但在特定條件下有利于生物體產(chǎn)生遺傳變異來應(yīng)對脅迫［11］.Zm-1701基因的上游存在著Ac轉(zhuǎn)座子插入元件，因此推測該ncRNA可能參與玉米的逆境應(yīng)答反應(yīng).為了進(jìn)一步驗證Zm-1701的功能，對3葉期的玉米實施一定的逆境處理，用PEG6000和ABA模擬干旱脅迫，用高濃度的NaCl模擬鹽脅迫，選擇對脅迫敏感的組織-根作為研究對象，利用前人研究結(jié)果中得到的脅迫效應(yīng)基因DREB2A，dbf1，dhn1來確定脅迫的具體作用時間.3個基因的半定量RT-PCR結(jié)果如圖2所示，圖A表明，在PEG6000濃度為20%，處理時間為1 h時，dbf1基因開始大量表達(dá)，到6 h后開始下降，說明PEG6000處理1 h后玉米根中干旱脅迫響應(yīng)基因大量表達(dá).圖B顯示在ABA濃度為100μmol·L-1，處理時間為3 h時，dhn1基因開始大量表達(dá)，隨后逐漸增多，到24 h后仍無下降趨勢，說明ABA處理3 h后脅迫響應(yīng)機(jī)制開始啟動.圖C顯示在150 mmol·L-1NaCl處理3 h后，DREB2A基因表達(dá)量開始上升，至24 h后逐漸下降，表明NaCl處理3 h后，玉米根中鹽脅迫效應(yīng)機(jī)制啟動.

Zm-1701在3種脅迫條件下的表達(dá)情況如圖3所示.Zm-1701在正常生長條件下都有表達(dá)，PEG6000處理后，表達(dá)量逐漸增多，6 h時被大量誘導(dǎo)(圖3-A).ABA脅迫的結(jié)果和PEG6000相似，隨著處理時間的延長，Zm-1701的表達(dá)量逐漸升高，但其效應(yīng)靈敏性不及PEG6000，24 h時才被大量誘導(dǎo)表達(dá)(圖3-B).Zm-1701對鹽脅迫反應(yīng)比較靈敏，NaCl處理后3 h，它的表達(dá)量已明顯增加，但隨后又呈下降趨勢(圖3-C).

圖2 3個脅迫響應(yīng)基因半定量RT-PCR結(jié)果Fig.2 Semi-quantitative RT-PCR results of three stress response genes

圖3 3種脅迫條件下Zm-1701 Northern雜交結(jié)果Fig.3 Expression results of Zm-1701 under 3 stresses by Northern blot

3 討論

在構(gòu)建了玉米非編碼RNA cDNA文庫的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了1個從基因外顯子序列上轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的ncRNA，該RNA位于1個Ac轉(zhuǎn)座子插入位點的下游.轉(zhuǎn)座子是植物中大量存在的可移動轉(zhuǎn)座元件，在植物基因組的改造和突變過程中發(fā)揮著重要作用，植物在受到外界逆境脅迫時，能夠激活自身基因組中處于休眠狀態(tài)的轉(zhuǎn)座子［11，12］.殷文超等［13］發(fā)現(xiàn)，在NO脅迫產(chǎn)生的水稻突變株中，轉(zhuǎn)座子mPing發(fā)生轉(zhuǎn)座激活.HE等［14］研究發(fā)現(xiàn)，接種水稻稻瘟病病菌后，水稻內(nèi)源CACTA類轉(zhuǎn)座子Rim2轉(zhuǎn)錄活性增加.TANISAKA［15］和 TSUGANE［16］發(fā)現(xiàn)水稻材料在受到γ-射線輻照后轉(zhuǎn)座子mPing和nDart1被激活.本研究發(fā)現(xiàn)，位于Ac轉(zhuǎn)座子下游的ncRNA Zm-1701，在玉米受到干旱或鹽脅迫時被誘導(dǎo)大量表達(dá)，其是否作為Ac轉(zhuǎn)座子的一部分參與玉米逆境信號響應(yīng)過程中還需要進(jìn)一步的研究.

植物的生長過程常受到許多不良環(huán)境的影響，在長期的進(jìn)化過程中，植物為了適應(yīng)環(huán)境逐漸建立了自身的適應(yīng)和抗性機(jī)制.干旱、高溫、鹽漬等逆境嚴(yán)重影響了植物的生長，當(dāng)植物受到脅迫時體內(nèi)會產(chǎn)生一系列生理、生化反應(yīng)，許多脅迫響應(yīng)基因被誘導(dǎo)表達(dá).近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，人們對植物響應(yīng)逆境脅迫機(jī)制的認(rèn)識逐漸加深，許多相關(guān)基因及一些轉(zhuǎn)錄因子被相繼鑒定、克?。?7～20］.從非編碼RNA角度研究植物的逆境響應(yīng)機(jī)制的報道大都集中在 miRNA 方面［5，6，21～24］，對中等長度片段ncRNA調(diào)控植物發(fā)育的機(jī)制的研究還很少.從長片段ncRNA的角度研究非編碼RNA參與植物逆境響應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，有可能為玉米轉(zhuǎn)基因改良提供一定的理論依據(jù).

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